ubi-FLIa包括：P35S啟動子、TEV增強子、bar 基因、大豆貯藏蛋白基因vsp終止子、玉米ubi啟動子、FLIa基因和根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成 酶基因nos終止子，具體如表1所示。
[0056] 表1植物表達載體pTFlOl. Ι-ubi-FLIa主要元件信息及功能
[0057]
[0058]
[0059] 實施例3轉(zhuǎn)FLIa基因玉米植株的獲得
[0060] 采用農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉(zhuǎn)化法，具體步驟如下：
[0061] 1、含有植物表達載體pTFlOl.Ι-ubi-FLIa的農(nóng)桿菌EHA105在YEP固體培養(yǎng)基上 涂布，28°C下暗培養(yǎng)1~3天；將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌從平板上刮下重懸，調(diào)0D55。至0. 3,制成侵 染液。
[0062] 2、取授粉9~12d的玉米HiII幼穗，剝?nèi)∮着哂谇秩疽褐星秩?min;侵染結(jié)束后， 幼胚盾片朝上接種于共培養(yǎng)基中，20°C暗培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)至靜息培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)7天。
[0063] 3、將正常發(fā)育的幼胚轉(zhuǎn)至含有1. 5mg/L雙丙氨膦的選擇培養(yǎng)基I中，28°C暗培養(yǎng) 2周；將誘導的初始愈傷組織轉(zhuǎn)至含有3mg/L雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基II中，28°C暗培養(yǎng)2 周，以后每兩周更換一次篩選培養(yǎng)基II。
[0064] 4、當篩選得到的抗性愈傷組織增殖至直徑2cm左右時，將其轉(zhuǎn)至暗分化培養(yǎng)基 中，25°C暗培養(yǎng)2~3周；將分化得到的胚芽鞘轉(zhuǎn)至光分化培養(yǎng)基中，25°C光下培養(yǎng)2周；待 胚芽鞘形成完整的莖、葉和根后，將植株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中促根壯苗10天。
[0065] 5、將植株移栽入營養(yǎng)缽，人工氣候室中培養(yǎng)；待植株長出1~2片新葉后移入大花 盆，轉(zhuǎn)移至溫室。
[0066] 6、當植株生長至4~6葉期，取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測外源基因，PCR鑒 定中所用引物及反應條件如表2所示，植株開花后套袋授粉自交結(jié)實；種子播種在大田，植 株長至4~6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測外源基因，PCR鑒定中所用引物及 反應條件如表2所示。
[0067] 如圖6所示，PCR檢測結(jié)果表明，F(xiàn)LIa基因已經(jīng)轉(zhuǎn)移并整合入玉米植物基因組中， 由此證明，已經(jīng)成功獲得了轉(zhuǎn)FLIa基因玉米植株。
[0068] 表 2
[0069]
[0070] 實施例4檢測FLIa基因在轉(zhuǎn)化玉米植物中的表達
[0071] 采用Bt-CrylAb/Ac免疫檢測試紙條檢測FLIa基因的表達情況，具體步驟如下：
[0072] 1、取約0·3g新鮮幼嫩葉片（來自實施例3制備的轉(zhuǎn)FLIa基因玉米植株）放在 2ml的離心管中；然后將放有葉子的管插在冰盒中，以保持新鮮度。
[0073] 2、取液氮，將材料速凍，用鉆頭將材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL-lmL SEB4樣品提取緩沖液。
[0074] 3、取出檢測試紙條，手持檢測試紙條頂端，做好檢測標記，不要去掉保護膜；保持 檢測試紙條垂直，將末端插入至離心管中，插入部分不要超過〇.5cm，在檢測過程中始終保 持插入狀態(tài)。
[0075] 4、3_5分鐘內(nèi)出現(xiàn)反應條帶。
[0076] 陽性結(jié)果：在檢測試紙條上出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條檢測線（紅色）和一條質(zhì)控線 (紅色）。
[0077] 陰性結(jié)果：在檢測試紙條上僅出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線。
[0078] 試紙條檢測結(jié)果如圖7所示：FLIa基因在轉(zhuǎn)FLIa基因玉米植株中得到了很好的 表達。
[0079] 實施例5轉(zhuǎn)FLIa基因玉米植株拔節(jié)期葉片室內(nèi)抗蟲性鑒定
[0080] 轉(zhuǎn)FLIa基因玉米植株拔節(jié)期取葉片分別放入不同平皿中，每個平皿接5只初孵玉 米螟幼蟲，3次重復；接蟲4天后觀察葉片損傷情況。結(jié)果如圖8所示：非轉(zhuǎn)基因植株葉片 被玉米螟蛀蝕出很多蟲孔，表現(xiàn)為感蟲；轉(zhuǎn)FLIa基因玉米植株葉片沒有蟲孔，表現(xiàn)為抗蟲。
【主權項】
1. 一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa，其特征在于，該基因的核苷酸序列如序列表中的 SEQIDN0:1 所示。2. 如權利要求1所述的一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa編碼的蛋白，其特征在于，該 蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQIDN0:2所示。3. 植物表達載體pTFlOl. 1-ubi-FLIa，其特征在于，該載體含有人工合成的Bt抗蟲基 因FLIa，該載體的核苷酸序列如序列表中的SEQIDN0:3所示。4. 根據(jù)權利要求3所述的植物表達載體pTFlOl. 1-ubi-FLIa，其特征在于，用EcoR I和HindIII酶切植物表達載體pCAMBIA3300,回收酶切位點間的片段ubi-nos，連入植 物表達載體pTFlOl. 1的EcoRI和HindIII位點間，構建植物表達載體pTFlOl.Ι-ubi; 將人工合成的兩端帶有SmaI和SacI酶切位點的Bt抗蟲基因FLIa，連入植物表達 載體pTFlOl.Ι-ubi的SmaI和SacI位點間，構建抗蟲基因FLIa的植物表達載體 pTFlOl.Ι-ubi-FLIa，其核苷酸序列如SEQIDN0:3 所示。5. 根據(jù)權利要求3或4所述的植物表達載體pTFlOl. 1-ubi-FLIa，其特征在于，該載體 包括：P35S啟動子、TEV增強子、bar基因、大豆藏蛋白基因vsp終止子、玉米ubi啟動子、 FLIa基因和根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因nos終止子。6. 制備權利要求1所述的人工合成的Bt抗蟲基因FLIa的方法，其特征在于，包括以下 步驟： 步驟一、將抗蟲基因CrylAb的DomainI和DomainII與抗蟲基因Crylla的DomainIII進行交換融合，獲得重組抗蟲基因MCryll; 步驟二、在重組抗蟲基因MCryll的基礎上，在3'端連入抗蟲基因Cryljal的碳末端， 得到重組抗蟲基因FLMCrylla ; 步驟三、對重組抗蟲基因FLMCrylla進行密碼子改造，獲得Bt抗蟲基因FLIa，其核苷酸 序列如序列表中的SEQIDNO: 1所示。7. 根據(jù)權利要求6所述的人工合成的Bt抗蟲基因FLIa的制備方法，其特征在于，步驟 二中，所述重組抗蟲基因FLMCrylla與Cry基因氨基酸序列最大同源性為88%。8. 根據(jù)權利要求6所述的人工合成的Bt抗蟲基因FLIa的制備方法，其特征在于，步驟 三中，對重組抗蟲基因FLMCrylla進行密碼子改造包括：基因編碼框優(yōu)化、消除稀有密碼子 而利用最佳化密碼子、二級結(jié)構最小化、調(diào)整GC含量。9. 一種提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性的方法，其特征在于，將人工合成的Bt抗蟲基因FLIa轉(zhuǎn) 化植物中，提高轉(zhuǎn)化植物的抗蟲性。10. -種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa在提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性中的應用。
【專利摘要】一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa及其制備方法和應用，屬于抗蟲蛋白及生物安全技術領域。該Bt抗蟲基因FLIa的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ？ID？NO:2所示。該Bt抗蟲基因FLIa的制備方法為：將抗蟲基因Cry1Ab的Domain？Ⅰ和Domain？Ⅱ與抗蟲基因Cry1Ia的Domain？Ⅲ進行交換融合，獲得重組抗蟲基因MCry1I；在重組抗蟲基因MCry1I的基礎上，在3’端連入抗蟲基因Cry1Ja1的碳末端，得到重組抗蟲基因FLMCry1Ia；對重組抗蟲基因FLMCry1Ia進行密碼子改造，獲得Bt抗蟲基因FLIa。該Bt抗蟲基因FLIa可在轉(zhuǎn)化植物中穩(wěn)定遺傳和表達，且表達量高，所得轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性好。該基因轉(zhuǎn)化玉米、棉花、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，以減少環(huán)境污染和生產(chǎn)成本。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82, C07K14/325, C12N15/10, C12N15/32
【公開號】CN105349555
【申請?zhí)枴緾N201510917151
【發(fā)明人】郝東云, 劉相國, 李楠, 韓四平, 尹悅佳, 柳青, 劉洋, 康領生, 王陽, 閆瑋玉
【申請人】吉林省農(nóng)業(yè)科學院
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月11日