一種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒mvm株與mpv株的hrm檢測(cè)方法及引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)領(lǐng)域,具體涉及一種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株 的HRM檢測(cè)方法及引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 小鼠細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒屬的單股負(fù)鏈DNA病毒,在普通級(jí)小鼠中感染率較 高。MVM株首次發(fā)現(xiàn)于1966年,在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)該病毒株在生物體內(nèi)有抑制腫瘤的作用; 起初被認(rèn)為是孤立的細(xì)小病毒株的MPV株最早是在1933年從L3殺傷性T淋巴細(xì)胞中分離 出來(lái)的。MVM株和MPV株和其他的細(xì)小病毒一樣具有強(qiáng)的物理穩(wěn)定性,對(duì)酸堿、溫度等有一 定的耐受能力。在生物制品的生產(chǎn)中,許多生物制品所用的細(xì)胞系來(lái)源于鼠源細(xì)胞如中國(guó) 倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0)、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞等,而這些細(xì)胞容易受細(xì)小毒株污染。自然感染細(xì)小病 毒的鼠群通常是無(wú)癥狀的,但研究表明幼鼠及免疫不全的鼠感染MVM株出現(xiàn)矮小癥,突發(fā) 死亡及造血功能障礙等。相比MVM株感染,研究報(bào)道實(shí)驗(yàn)室和自然感染MPV株的小鼠均無(wú) 病理狀態(tài)。由于臨床感染的癥狀弱或無(wú)癥狀以及細(xì)小病毒強(qiáng)的生存力,使其成為目前動(dòng)物 屏障設(shè)施中一種很難根除的病原。
[0003] 體外檢測(cè)小鼠細(xì)小病毒株的方法有多種,如ELISA、感染實(shí)驗(yàn)、血凝實(shí)驗(yàn),免疫熒光 法、PCR方法等。鑒于感染后一些未能發(fā)生血清轉(zhuǎn)換的小鼠則無(wú)法通過(guò)血清抗體檢測(cè),因而 快速、靈敏的PCR檢測(cè)方法被常用于細(xì)小病毒的日常檢測(cè)。細(xì)小病毒的組織嗜性廣泛,在小 鼠肝、腎、脾、盲腸內(nèi)容物、糞便中等均能檢測(cè)病毒。目前已有的PCR檢測(cè)方法有單獨(dú)檢測(cè) MVM株或MPV株,檢測(cè)兩種毒株但不區(qū)分是哪種毒株,所以迫切需要一種既可檢測(cè)兩種小鼠 細(xì)小毒株又能夠鑒別是MVM株還是MPV株的檢測(cè)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的HRM檢測(cè)方 法及引物。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是: 一種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的HRM檢測(cè)方法的引物,其核苷酸序列如 下所示: PI:GACCTYACWGCTTSCATGAT(SEQIDNO:1); P2:GTGWGGYTGACAAAATCCWACTT(SEQIDNO:2)〇
[0006] -種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的HRM檢測(cè)試劑盒,該試劑盒含有上 述的引物。
[0007] -種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的的HRM檢測(cè)方法,包括以下步驟: 1) 從樣品中提取病毒核酸; 2) 以核酸為模板,利用上述引物對(duì)P1和P2以及熒光飽和染料,進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增 產(chǎn)物; 3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析,確定病毒類型。
[0008] 優(yōu)選的,步驟2)中擴(kuò)增反應(yīng)體系如下: Premix Εχ-Taq1〇μL 引物PI0.5μL 引物Ρ2 0.5μL LC green染料 lKL 模板 1Λ ddH20 7μL 總體積 2〇μL。
[0009] 優(yōu)選的,步驟2)中擴(kuò)增反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s,55°C退 火3〇8,72°(:延伸358;循環(huán)35次;72°(:終延伸51^11。
[0010] 優(yōu)選的,步驟3)中HRM分析儀器熔解溫度設(shè)定是以每步升溫0. 3°C的速率從80°C 到90°C進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。
[0011] 優(yōu)選的,步驟3)中HRM分析的具體分析過(guò)程:在80-90°C熔解溫度范圍內(nèi),若待檢 測(cè)樣品熔解曲線有兩個(gè)熔解區(qū)間即峰型曲線有兩個(gè)熔解峰時(shí),判定該樣品為小鼠細(xì)小病毒 MVM株;只有一個(gè)熔解峰的判定為小鼠細(xì)小病毒MPV株。
[0012] 優(yōu)選的,步驟3)中HRM分析的具體分析過(guò)程:在99%的置信區(qū)間內(nèi),當(dāng)檢測(cè)樣品含 有2個(gè)熔解峰時(shí),若2個(gè)熔解峰的Tm值分別為84. 63±0. 42°C、86. 76±0. 36°C,且二者差 值的絕對(duì)值為2. 13±0. 08°C,則判定該樣品為小鼠細(xì)小病毒MVM型毒株;當(dāng)檢測(cè)樣品只有1 個(gè)熔解峰,熔解Tm值為85. 4±0. 36°C時(shí),則判定為小鼠細(xì)小病毒MPV型毒株。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是: 1)本發(fā)明首次建立了一種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的HRM檢測(cè)方法及 引物,只需PCR體系中加入熒光飽和染料進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng);檢測(cè)速度快,全部操作過(guò)程只 需2小時(shí);費(fèi)用低,不需要特異性探針,熒光飽和染料用量少;可以簡(jiǎn)單、快速的實(shí)現(xiàn)高通 量分析,適合于小鼠細(xì)小病毒篩查。
[0014] 2)本發(fā)明的PCR-HRM引物,對(duì)小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株均有很好的擴(kuò)增性, PCR擴(kuò)增效率高,檢測(cè)靈敏度相當(dāng)于熒光定量PCR。
[0015] 3)本發(fā)明的PCR-HRM引物特異性好,能夠特異性擴(kuò)增小鼠細(xì)小病毒DNA而不擴(kuò)增 小鼠常見(jiàn)的其他病毒性和細(xì)菌病原,保證了本方法的可靠性。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線; 圖2為小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM峰型化熔解曲線; 圖3為小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株臨床樣品HRM標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線; 圖4為小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株臨床樣品HRM峰型化熔解曲線; 圖5為特異性試驗(yàn)?zāi)z電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明,但并不局限于此。
[0018] 實(shí)施例1特異性引物的設(shè)計(jì) 本發(fā)明設(shè)計(jì)可以同時(shí)檢測(cè)小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的引物;并對(duì)所設(shè)計(jì)的引物做 大量的實(shí)驗(yàn)篩選,篩選出一對(duì)特異性強(qiáng)的引物,其核苷酸序列如下所示: PI:GACCTYACWGCTTSCATGAT(SEQIDNO:1); P2:GTGWGGYTGACAAAATCCWACTT(SEQIDNO:2); 引物所擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均為516bp。
[0019] 實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及PCR-HRM分析 1)小鼠細(xì)小病毒DNA的提取: 采用天根DNA提取試劑盒提取樣品中的小鼠細(xì)小病毒DNA,樣品組織可以是組織臟器、 糞便或細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0020] 2 )陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備: 為了驗(yàn)證本發(fā)明方法可行性與可靠性,同時(shí)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品,為之后的臨床樣品檢 測(cè)提供HRM陽(yáng)性對(duì)照,本發(fā)明需優(yōu)先制備小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品。標(biāo) 準(zhǔn)樣品的制備步驟如下:分別取經(jīng)過(guò)測(cè)序確定為MVM株和MPV株的質(zhì)粒DNA作為模板(質(zhì) 粒濃度稀釋至Kfcopies/yL),以P1和P2為上下游引物在加有熒光飽和染料下的進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,其預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:
PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min;94°C變性30s,55°C退火30s,72°C延伸35s;循環(huán)35次;72°C終延伸5min;HRM分析儀器熔解溫度設(shè)定是以每步升溫0. 3°C的速率從 80°C到90°C進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。
[0021] 3)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR-HRM結(jié)果分析 HRM分析過(guò)程在Rotor-GeneQ分析儀進(jìn)行,該儀器可以完成PCR-HRM分析全過(guò)程,也 可以在普通PC