R儀上完成PCR擴增再將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)移至Rotor-GeneQ中完成熔解分 析。由于無需開蓋，從而保證了PCR產(chǎn)物不受污染。小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株標(biāo)準(zhǔn)樣 品HRM結(jié)果如圖1、圖2所示。
[0022] 圖1為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PCR擴增產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線圖，MVM株與MPV株熔解曲線差異 明顯。圖2為熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖即峰型熔解曲線，其中MVM株擴增的熔解曲線有兩個峰，Tml 平均值為84. 75°C、Tm2平均值為86. 85°C、ATm(Tm2-Tml)平均值為2. 10°C;MPV株熔解 曲線為單峰型，平均Tm值為85. 57°C。
[0023] 實施例3臨床樣品的PCR-HRM檢測 1) 從樣本中提取病毒DNA:方法同實施例2中DNA提取方法； 2) 以提取的DNA為模板，進行PCR擴增，擴增反應(yīng)體系為：
PCR擴增反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸35s;循環(huán)35次；72°C終延伸5min;HRM分析儀器熔解溫度設(shè)定是以每步升溫0. 3°C的速率從 80°C到90°C進行熒光信號的收集。
[0024] 3)對擴增產(chǎn)物進行HRM分析，確定小鼠細(xì)小毒株類型 本發(fā)明對28份臨床樣本進行檢測，檢測結(jié)果如圖3、4。
[0025] 圖3為PCR擴增產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線圖，兩種毒株P(guān)CR擴增產(chǎn)物熔解曲線差異明 顯。圖4為峰型熔解曲線圖。通過對圖形的分析，發(fā)現(xiàn)其中有20份樣本熔解曲線有兩個熔 解區(qū)間即峰型曲線有兩個熔解峰的，判斷為小鼠細(xì)小病毒MVM株；另外8份樣本熔解曲線只 有一個熔解區(qū)間即峰型曲線只有一個熔解峰的，判斷為小鼠細(xì)小病毒MPV株。
[0026] 進一步對熔解曲線進行分析：小鼠細(xì)小病毒MVM株陽性樣品熔解曲線表現(xiàn)為雙峰 型，第一個熔解峰的Tm值（Tml)統(tǒng)計為84. 63±0. 14°C，第二個熔解峰的Tm值（Tm2)統(tǒng)計 為 86. 76±0. 12°C，ATm(Tm2-Tml)值為 2. 13±0. 027°C;MPV株陽性樣品熔解曲線Tm值 為85. 4±0. 12°C。由于實際檢測中熔解曲線Tm受多方面因素的影響會有些變化，包括核酸 片段本身、反應(yīng)試劑鹽離子濃度及飽和熒光染料濃度微弱變化，故介定一個寬的Tm范圍。
[0027] 以本發(fā)明引物和方法，在99%置信區(qū)間內(nèi)，當(dāng)檢測樣品含有2個熔解峰時，若Tml 范圍為 84. 63±0. 42°C、Tm2 范圍為 86. 76±0. 36°C且ATm(Tm2-Tml)值為 2. 13±0. 08°C 則判定該樣品含小鼠細(xì)小病毒MVM型毒株；當(dāng)檢測樣品只有1個熔解峰，熔解Tm值在 85. 4±0. 36°C時，判定為小鼠細(xì)小病毒MPV型毒株。
[0028] 另外，對這28份樣品用針對保守基因的引物進行擴增并測序，做進化分析，分析 結(jié)果與本發(fā)明方法檢測的結(jié)果完全一致，說明本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性高，可達(dá)1〇〇%。
[0029] 實施例4特異性試驗 選取小鼠易感的幾種DNA病毒和細(xì)菌進行特異性檢測，選取的病毒有大鼠細(xì)小病毒KRV株、鼠痘病毒（ECT)、小鼠腺病毒（MAV)、小鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV)、多瘤病毒（Po1y)、肝螺 桿菌（/Z Ae/ja 和鼠傷寒沙門氏菌（51 皿τ/ω?)。將非小鼠細(xì)小病毒樣本與陽性 標(biāo)準(zhǔn)品按照相同的加樣體系和PCR反應(yīng)條件進行反應(yīng)，分析PCR產(chǎn)物熔解曲線結(jié)果。
[0030] 特異性試驗?zāi)z電泳圖結(jié)果如圖5所示。圖5表明除了陽性標(biāo)準(zhǔn)品對照外，其他 非小鼠細(xì)小病毒病原電泳圖中未出現(xiàn)目的條帶。非細(xì)小病毒病原的未能擴增的實驗依據(jù)保 證了本發(fā)明所涉及的引物的特異性，進一步也保證了本發(fā)明方法的可靠性。
[0031] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限 制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均 應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的HRM檢測方法的引物，其核苷酸序列 如下所示： PI:GACCTYACWGCTTSCATGAT(SEQIDNO：1)； P2:GTGWGGYTGACAAAATCCWACTT(SEQIDNO：2)〇2. -種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的HRM檢測試劑盒，其特征在于：該試 劑盒含有權(quán)利要求1所述的引物。3. -種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的的HRM檢測方法，其特征在于，包括以 下步驟： 1) 從樣品中提取病毒核酸； 2) 以核酸為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物對P1和P2以及熒光飽和染料，進行擴增 反應(yīng)獲得擴增產(chǎn)物； 3) 對擴增產(chǎn)物進行HRM分析，確定病毒類型。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中擴增反應(yīng)體系如下： PremixΕχ-Taq 1〇μL 引物PI 0.5μL 引物Ρ2 0.5μL LCgreen染料 lKL 模板 1Λ ddH20 7μL 總體積 2〇μL。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟2)中擴增反應(yīng)程序如下：94°C 預(yù)變性3min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸35s;循環(huán)35次；72°C終延伸5min。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟3)中HRM分析儀器熔解溫度設(shè)定是 以每步升溫0. 3°C的速率從80°C到90°C進行熒光信號的收集。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟3)中HRM分析的具體分析過程：在 80-90°C熔解溫度范圍內(nèi)，若待檢測樣品熔解曲線有兩個熔解區(qū)間即峰型曲線有兩個熔解 峰時，判定該樣品為小鼠細(xì)小病毒MVM株；只有一個熔解峰的判定為小鼠細(xì)小病毒MPV株。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：步驟3)中HRM分析的具體分析過 程：在99%的置信區(qū)間內(nèi)，當(dāng)檢測樣品含有2個熔解峰時，若2個熔解峰的Tm值分別為 84. 63±0. 42°C、86. 76±0. 36°C，且二者差值的絕對值為2. 13±0. 08°C，則判定該樣品為小 鼠細(xì)小病毒MVM型毒株；當(dāng)檢測樣品只有1個熔解峰，熔解Tm值為85. 4±0. 36°C時，則判 定為小鼠細(xì)小病毒MPV型毒株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速鑒別小鼠細(xì)小病毒MVM株與MPV株的HRM檢測方法及引物。其操作簡單：只需PCR反應(yīng)之前加熒光飽和染料即可；檢測速度快且高通量：全部操作過程只需2小時，極大縮短了分型所需時間；費用低，不需要特異性熒光標(biāo)記探針；準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地進行分析，有利于在臨床實踐中推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12R1/93, C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號】CN105349700
【申請?zhí)枴緾N201510852572
【發(fā)明人】饒丹, 郭鵬舉, 袁文, 黃韌, 張鈺, 陳梅麗
【申請人】廣東省實驗動物監(jiān)測所
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月27日