檸檬酸鐵銨、氯化亞 鐵、醋酸亞鐵和硫酸亞鐵。一些實(shí)施方案中，鐵源為檸檬酸鐵銨（FeNHfitrate)。
[0041] 發(fā)酵培養(yǎng)基中的鎂源可為一種或多種水溶性鎂鹽如氯化鎂、葡萄糖酸鎂、硝酸鎂、 硫酸鎂、檸檬酸鎂、醋酸鎂或琥珀酸鎂。一些實(shí)施方案中，鎂源為硫酸鎂（MgS04*7H20)。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明，嗜硫小紅卵菌的發(fā)酵培養(yǎng)基可包括，30_45g/L的量的碳源、 0. 4-0. 7g/L的量的磷源、1. 5-3.Og/L的量的氮源、1. 5-2. 5g/L的量的酵母提取物、 0.5-l.Og/L的量的鐵源、0· 15-0.3g/L的量的鎂源、10-30g/L的量的NaCl和微量成分 (traceelement)〇
[0043] -些實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述成分的混合物：檸檬酸、CaCl2*2H20、 MgS04*7H20、檸檬酸鐵銨、琥珀酸、琥珀酸二鈉*6H20、Na2S04、K2C03、酵母提取物、NH4C1、 ΚΗ2Ρ04、Κ2ΗΡ0/3Η20、NaCl、NaOH、Κ0Η、消泡劑和微量成分。微量成分可為C〇C12*6H20、 NiCl2*6H20、CuC12*2H20、MnCl2*4H20、ZnS04*7H20、Na2Mo04*2H20、H3B03和ΚΙ，和消泡劑可為用 于發(fā)酵方法的任何消泡劑如Y-30或Biospumex。
[0044] 一些實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述量的下述成分：30. 0-40.Og/L琥珀 酸；2. 0-4.Og/LNa2S04;0. 5-1.Og/LCaCl2;0· 2-0. 5g/LK2C03;0. 5-1.Og/L檸檬酸鐵 銨；1· 5-2. 5g/L酵母提取物；3· 0-6.Og/L檸檬酸；0· 15-0. 3g/LMgS04; 10-30g/LNaCl; 1. 5-3.Og/LNH4C1 ;0· 2-0. 4g/LKH2P04;和 2. 0-3.Og/LK2HP04。
[0045] 分批補(bǔ)料式發(fā)酵方法期間，本文中有時(shí)還提及稱作〃進(jìn)料〃的碳源、氮源和磷源的 溶液各自放在連接至發(fā)酵罐容器的外部貯存器中。碳源，本文中稱作〃琥珀酸鹽碳源"，為 琥珀酸和琥珀酸二鈉的水溶液；無(wú)機(jī)化合物氮源優(yōu)選NH4C1的水溶液；和磷源為KH2P〇dP K2HP04*3H20的水溶液。
[0046] 整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)碳水平，并且每當(dāng)培養(yǎng)基中琥珀酸的水平達(dá)到一定的閾值水 平例如l-2g/L時(shí)，將琥珀酸從外部貯存器添加（栗送）至發(fā)酵罐。
[0047] 整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)磷水平，并且必要時(shí)添加新鮮的磷源。一些實(shí)施方案中，在發(fā) 酵開始后16小時(shí)的早期將新鮮的磷酸鹽溶液從外部貯存器栗送至發(fā)酵罐，然后每24小時(shí) 周期進(jìn)一步添加。
[0048] 整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)氨水平，并且必要時(shí)添加新鮮的氮源。一些實(shí)施方案中，在發(fā) 酵開始后16小時(shí)的早期將新鮮的氨溶液（NH4C1 5N)從外部貯存器栗送至發(fā)酵罐，然后每 24小時(shí)周期進(jìn)一步添加。
[0049] 必要時(shí)，進(jìn)料的體積應(yīng)當(dāng)盡可能地最小化，從而可添加琥珀酸鹽溶液以延長(zhǎng)發(fā)酵 過(guò)程。發(fā)酵開始時(shí)，由于pH升高至8. 6,所以使用硫酸來(lái)維持pH= 7。發(fā)酵期間，添加NaOH 溶液以維持pH= 7。此時(shí)，核查琥珀酸的量，并且當(dāng)其達(dá)到l-2g/L的量時(shí)，應(yīng)當(dāng)從外部貯存 器添加琥珀酸（代替硫酸）。
[0050] 發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基如下制備：通過(guò)向檸檬酸、CaCl2*2H20,MgS04*7H20和檸檬 酸鐵銨的水溶液（下文中"溶液Γ)添加琥珀酸、Na2S04、K2C0#P酵母提取物的水溶液（下 文中〃溶液2")，接著添加NaCl，混合，并添加NH4C1的溶液（下文中〃溶液3")來(lái)制備溶液 (下文中〃溶液4〃），并使用10NNaOH調(diào)整pH至5,接著將消泡劑的水溶液添加至溶液4， 關(guān)閉發(fā)酵罐并通過(guò)高壓滅菌法（121°C，20分鐘）滅菌，并進(jìn)一步向無(wú)菌培養(yǎng)基添加微量成 分CoCl2*6H20、NiCl2*6H20、CuCl2*2H20、MnCl2*4H20、ZnS04*7H20、Na2Mo04*2H20、H3B03和KI的 水溶液，接著添加磷酸鹽KH2P04、K2HP0/3H20的水溶液，由此在發(fā)酵罐容器中形成初始發(fā)酵 培養(yǎng)基。將嗜硫小紅卵菌的接種物（inoculum)添加至發(fā)酵罐中的該初始發(fā)酵培養(yǎng)基，并且 在發(fā)酵期間，必要時(shí)將新鮮量的琥珀酸鹽碳源、氯化銨氮源和磷酸鹽源添加至發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0051] 添加嗜硫小紅卵菌的接種物之前發(fā)酵罐中的溫度應(yīng)當(dāng)為約28°C并且pH= 7 (需要 時(shí)用NaOH和琥珀酸鹽溶液調(diào)整）。
[0052] 發(fā)酵期間，應(yīng)當(dāng)維持良好的攪拌和通氣，并且應(yīng)當(dāng)監(jiān)測(cè)溫度、pH、氧水平、以及氮、 碳和磷的供給。溫度應(yīng)當(dāng)維持在最低25°C和最高31°C并且pH的控制上下限為6. 8和7. 3。
[0053] 非常重要的是，發(fā)酵約10-20小時(shí)后保持氧為10%或低于10%。高濃度的氧加速 細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是它們不產(chǎn)生細(xì)菌葉綠素a，然而10%濃度的氧加速細(xì)菌葉綠素a的產(chǎn)生。
[0054] 繼續(xù)發(fā)酵直至容器內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基的體積增加至約其全部容積。
[0055] -旦發(fā)酵完成，離心湯液（broth)，丟棄上清液，凍干細(xì)胞并從干燥細(xì)胞中提取 Bchla。可純化Bchla并用于所需細(xì)菌葉綠素衍生物的化學(xué)衍生。
[0056] 現(xiàn)將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
[0057] 實(shí)施例
[0058] 材料和方法
[0059] 嗜硫小紅卵菌（DSMStrain1374)從DeutscheSammlungvonMikroorganismen undZellkulturen(DSMZ),Braunschweig,Germany獲得。
[0060] BioFloIV20L發(fā)酵罐來(lái)自NewBrunswickScientific(USA) 〇
[0061]琥珀酸、琥珀酸二鈉*6H20、NH4C1、FeNH4^檬酸鹽/檸檬酸、K2HP04、 MgCl2CoCl2*6H20、NiCl2*6H20、CuC12*2H20、MnCl2*4H20、ZnS04*7H20 和KI購(gòu)自Acros 0rganics(Geel,Belgium) ;KH2P04、Na2S04、KC1、CaCl2*2H20、K2C03、NaHC03MgS04*7H20 和 NaCl購(gòu)自Fisher(FisherScientific,Loughborough,UK);酪蛋白胨和酪蛋白水解物購(gòu)自 Difco(Lawrence,KS,USA);酵母提取物購(gòu)自DifcoandBioSpringer(Montreal,Quebec ，Canada) ;NH4C1 購(gòu)自Fluka(Sigma-Aldrich，Rehovot，Israel) ;KH2P04購(gòu)自Merck(Merck KGaA,DarmstadtGermany) ;K0H、H3B03、Y_30 消泡劑和Na2Mo04*2H20 購(gòu)自Sigma(Sigma-Ald rich,Rehovot,Israel)〇
[0062] 實(shí)施例1.嗜硫小紅卵菌細(xì)菌的工作細(xì)胞庫(kù)的制備
[0063] 將嗜硫小紅卵菌細(xì)菌（DSMStrain1374)播種在預(yù)鋪有生長(zhǎng)基質(zhì)的皮氏培養(yǎng) 皿（Petridishes)，生長(zhǎng)基質(zhì)包含與由下述成分制備的水性培養(yǎng)基混合的瓊脂：琥?白酸 (9g)、Na2S04(3g)、KC1 (750mg)、CaCl2(750mg)、NaHC03(300mg)、FeNH4citrate(150mg)、酵母 提取物（3g)、酪蛋白胨（1.5g)、酪蛋白水解物（1.5g)、MgCl2(7. 5g)、NaCl(30g)、去離子水 (1500ml)〇
[0064] 使用NaOH10Ν和HC1 1Μ將培養(yǎng)基的pH調(diào)整為7。將瓊脂添加至培養(yǎng)基（每500ml 培養(yǎng)基7. 5g瓊脂）以獲得生長(zhǎng)基質(zhì)。通過(guò)高壓滅菌法（121°C，30分鐘）將鋪有生長(zhǎng)基質(zhì) 的皮氏培養(yǎng)皿滅菌并在上面播種細(xì)菌。
[0065] 在30°C下孵化三天后，將細(xì)菌的接種物轉(zhuǎn)移至250ml的錐形瓶并在將有機(jī)氮源酪 蛋白胨（用于皮氏培養(yǎng)皿的細(xì)菌生長(zhǎng)）替換為無(wú)機(jī)源氯化銨的接種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。使細(xì)菌 生長(zhǎng)直至培養(yǎng)基液的光密度（〇D540nm)達(dá)到10以上的值。將8ml的小份接種物源轉(zhuǎn)移至 15ml無(wú)菌低溫冷凍管（sterilecryogenicfreezingtubes)，添加2ml的50%無(wú)菌甘油溶 液并將管保存在-80 °C直至使用。
[0066] 實(shí)施例2.用于發(fā)酵培養(yǎng)基的溶液及其制備
[0067] 制備下述溶液：
[0068] 溶液1。在發(fā)酵罐容器中如下述順序添加下述成分并溶解在4. 5L去離子水：
[0069]

[0070] 溶液2。如下述順序添加下述成分并溶解在400ml溫水中，并添加去離子水以達(dá)到 0. 5L：
[0071]
[0072] 溶液3。將氯化銨5N_M14CU約268g)浴觶在900ml水中并使體積達(dá)到1L。將 80ml的樣品轉(zhuǎn)移至100ml瓶以作為溶液3添加至發(fā)酵罐并將剩余物轉(zhuǎn)移至標(biāo)記為溶液3的 1L瓶中以用作發(fā)酵期間的氮源儲(chǔ)備。兩個(gè)瓶均在高壓滅菌器（121Γ，20分鐘）中滅菌。
[0073] 在發(fā)酵罐中通過(guò)將450ml的溶液2添加至已經(jīng)在發(fā)酵罐容器內(nèi)的4. 5L的溶液1 中，接著添加170gNaCl并混合，然后添加溶液3(公升培養(yǎng)基中NH4C15N，lgNH4+)以形成 溶液4。使用IONNaOH將pH調(diào)整為5。
[0074] 溶液5,微量成分溶液（TES)，在0· 5L水中包含下述成分：C〇C12*6H20(約50mg)、 NiCl2*6H20(約 50mg)、CuCl2*2H20(約 100mg)、MnCl2*4H20(約 150mg)、ZnS04*7H20(約 200mg)、H3B03 (約lOOOmg)、Na2Mo04*2H20 (約 50mg)和ΚΙ(約 500mg)。將 35ml溶液 5 的小 份轉(zhuǎn)移至l〇〇ml瓶中并通過(guò)高壓滅菌法（121°C，20分鐘）滅菌。
[0075] 溶液6,磷酸鹽溶液，通過(guò)在250ml去離子水中溶解30gKH2P0jP5gΚ 2ΗΡ04來(lái)制 備。使用10NΚ0