Η溶液將pH調(diào)整為7。將55ml的小份轉(zhuǎn)移至100ml瓶并標(biāo)記為溶液6添 加至發(fā)酵罐。將剩余物轉(zhuǎn)移至500ml瓶并標(biāo)記為溶液6來(lái)用作發(fā)酵期間的磷源儲(chǔ)備。兩個(gè) 瓶均在高壓滅菌器（121°C，20分鐘）中滅菌。
[0076] 溶液7,消泡溶液，通過(guò)將約25mg的硅類消泡劑Y-30添加至去離子水以使最終體 積為250ml、接著在高壓滅菌器（121°C，20分鐘）中滅菌，或添加消泡劑Biospumex以使其 濃度在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中為〇. 2至0. 5mL/L的范圍來(lái)制備。通常，引入至發(fā)酵罐的消泡劑 的量由培養(yǎng)基中形成的泡湯的量來(lái)決定。
[0077] 溶液8,用作碳源以及pH適配劑（adaptor)的琥泊酸鹽溶液，通過(guò)在4L去離子水 中溶解250g琥珀酸二鈉、添加450g琥珀酸、加溫以使其溶解然后添加去離子水以使最終體 積為5L，接著通過(guò)高壓滅菌法（121°C，20分鐘）滅菌溶液來(lái)制備。
[0078] 溶液9,NaOH10N，通過(guò)將250ml去離子水放入500ml瓶，通過(guò)高壓滅菌法（121 °C， 20分鐘）滅菌，添加100gNaOH至冷卻的瓶中并混合來(lái)制備。
[0079] 實(shí)施例3.用于生產(chǎn)Bchla的分批補(bǔ)料式發(fā)酵
[0080] 校準(zhǔn)pH電極并連接至發(fā)酵罐容器。將D0 (溶解氧）電極連接至容器。在發(fā)酵罐 容器關(guān)閉之前在發(fā)酵罐容器中在pH5下將2ml的消泡劑添加至溶液4,并將滅菌設(shè)定為25 分鐘的周期。
[0081 ] 初始發(fā)酵培養(yǎng)基包含下述成分：
[0082]
[0083] 在若干步驟中制備該培養(yǎng)基，其中首先在生物反應(yīng)器中制備初始發(fā)酵培養(yǎng)基， 并在發(fā)酵過(guò)程引發(fā)時(shí)從連接至生物反應(yīng)器的外部貯存器中的進(jìn)給溶液添加其它成分， 然后在發(fā)酵期間，連續(xù)地，隨后在線監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)素水平。磷供給溶液包含 KH2P04(12. 0-14. 5g/L)和1(2即04(1. 0-3.Og/L)，碳供給溶液包含琥珀酸（80. 0-100.Og/L)和 琥珀酸二鈉（40. 0-60.Og/L)，氮供給溶液包含200-300g/L的NH4C1。將上述全部溶液的pH 調(diào)整為7.0。
[0084] 為了引發(fā)發(fā)酵，將35ml無(wú)菌TES溶液（溶液5)添加至已包含已滅菌的溶液4的 發(fā)酵罐。然后，在攪拌（500rpm)和1WM(8公升/分鐘）通氣下添加55ml無(wú)菌磷酸鹽溶液 (溶液6)并且使發(fā)酵罐中的溫度確立在28 °C。
[0085] 將碳供給溶液（琥珀酸鹽溶液8)連接至進(jìn)給栗，接著將溶液7 (消泡溶液）連接 至進(jìn)給栗。需要時(shí)用無(wú)菌NaOH10N(溶液9)和無(wú)菌琥珀酸鹽溶液將生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH調(diào)整 為pH7。校準(zhǔn)D0 (溶解氧）電極。
[0086] 使用進(jìn)給栗將細(xì)菌接種物添加至發(fā)酵罐。細(xì)胞濃度為2. 3-3. 20D/L。最后，將磷酸 鹽溶液（溶液6)和氯化銨溶液（溶液3)連接至進(jìn)給栗。
[0087] 分批補(bǔ)料式發(fā)酵期間，將溫度保持在最低25°C和最高31°C之間，將氧水平保持為 10%或低于10%。pH控制在最低6. 8和最高7. 3之間。每當(dāng)pH高于7.1時(shí)添加琥泊酸鹽 溶液。每當(dāng)pH低于6. 8時(shí)添加NaOH10N(溶液9)。
[0088] 發(fā)酵16小時(shí)后，通過(guò)經(jīng)由蠕動(dòng)栗（栗速1ml/分鐘）栗送80ml溶液3 (NH4C15N)和 20ml溶液6 (磷酸鹽溶液）至發(fā)酵罐來(lái)更新生長(zhǎng)培養(yǎng)基的氮供給和磷供給。然后，每12小 時(shí)的時(shí)間添加90ml的NH4C1，并且每24小時(shí)的時(shí)間添加（栗送）20ml磷酸鹽。發(fā)酵期間監(jiān) 測(cè)氨和磷的水平并根據(jù)該監(jiān)測(cè)的分析結(jié)果添加溶液3和溶液6。
[0089] 每當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中琥珀酸的水平降低至l_2g/L時(shí)，通過(guò)添加琥珀酸（溶液8)來(lái) 更新碳供給。發(fā)酵約10-20小時(shí)后將氧水平保持為10%或低于10%。該氧水平加速細(xì)菌 葉綠素的產(chǎn)生。
[0090] 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的初始體積約為生物反應(yīng)器的體積的一半。繼續(xù)發(fā)酵長(zhǎng)達(dá)120小時(shí)， 并且體積增加至約生物反應(yīng)器的全容積。
[0091] 實(shí)施例4.細(xì)菌葉綠素a的提取
[0092] 發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)在4500rpm下離心15分鐘來(lái)除去細(xì)菌，并丟棄培養(yǎng)上清液。凍干 浸漬的細(xì)胞。使用甲醇從干燥（凍干的）細(xì)胞中提取Bchla。Bchla的產(chǎn)率為0. 15-0. 3gr/ 公升。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從嗜硫小紅卵菌生產(chǎn)細(xì)菌葉綠素a(Bchla)的分批補(bǔ)料式發(fā)酵方法，所述方法 包括： (i) 在發(fā)酵罐容器內(nèi)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜硫小紅卵菌，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含作為氮 源的無(wú)機(jī)氮化合物、碳源、磷源、鐵源、鎂源、酵母提取物和NaCl; (ii) 將琥珀酸鹽碳源、無(wú)機(jī)化合物氮源和磷源從連接至所述發(fā)酵罐容器的外部貯存器 進(jìn)給至所述培養(yǎng)基并保持氧水平為10%或低于10%，與此同時(shí)使培養(yǎng)物進(jìn)行分批補(bǔ)料式 發(fā)酵； (iii) 從所述培養(yǎng)基中除去細(xì)胞；和 (iv) 從來(lái)自步驟（iii)的細(xì)胞中分離并回收Bchla。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中步驟（i)中的所述無(wú)機(jī)氮化合物為氯化銨、硫 酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫銨、硝酸鉀、硝酸鈉、或其任何組合。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其中所述無(wú)機(jī)氮化合物為氯化銨。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的發(fā)酵方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所述碳源選 自單糖或二糖，蔗糖，包括蘋果酸、琥珀酸和琥珀酸鈉的二羧酸類，甘油，檸檬酸，或其任何 組合；所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所述磷源選自磷酸氫鹽和磷酸二氫鹽，或焦磷酸鹽的一種或多 種水溶性鹽，所述磷酸氫鹽和磷酸二氫鹽包括鈉、鉀和銨的磷酸氫鹽和磷酸二氫鹽；所述生 長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所述鐵源選自一種或多種水溶性鐵鹽或亞鐵鹽，包括檸檬酸鐵銨、氯化亞鐵、 醋酸亞鐵和硫酸亞鐵；和所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所述鎂源選自一種或多種水溶性鎂鹽，包括 氯化鎂、葡萄糖酸鎂、硝酸鎂、硫酸鎂、檸檬酸鎂、醋酸鎂或琥珀酸鎂。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中步驟（ii)中的所述琥珀酸鹽碳源為琥珀酸 和琥珀酸二鈉的水溶液；所述無(wú)機(jī)化合物氮源為NH4C1的水溶液，和所述磷源為KH2P〇dP K2HP04*3H20的水溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中步驟（i)中嗜硫小紅卵菌的所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基 包括檸檬酸、CaCl2*2H20、MgS04*7H20、檸檬酸鐵銨、琥珀酸、琥珀酸二鈉*6H20、Na2S04、K2C03、 酵母提取物、NH4C1、KH2P04、K2HP0/3H20、NaCl、NaOH、KOH、消泡劑和微量成分，所述微量成分 包含C〇C12*6H20、NiCl2*6H20、CuC12*2H20、MnCl2*4H20、ZnS04*7H20、Na2Mo04*2H20、H3B03和ΚΙ。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基如下制備： (a) 通過(guò)向檸檬酸、CaCl2*2H20、MgS04*7H20和檸檬酸鐵銨的水溶液（〃溶液Γ)添加琥 珀酸、Na2S04、K2C03和酵母提取物（下文中〃溶液2")的水溶液，接著添加NaCl，混合，并添 加NH4C1的溶液（下文中〃溶液3〃）來(lái)制備溶液4,并使用IONNaOH調(diào)整pH至5,接著向溶 液4添加消泡劑的水溶液，關(guān)閉發(fā)酵罐并通過(guò)高壓滅菌法滅菌，并進(jìn)一步向無(wú)菌培養(yǎng)基添 加所述微量成分CoCl2*6H20、NiCl2*6H20、CuCl2*2H20、MnCl2*4H20、ZnS04*7H20、Na2Mo04*2H20、 H3B0jPKI的水溶液，接著添加磷酸鹽ΚΗ2Ρ04、Κ2ΗΡ0/3Η20的水溶液，由此在發(fā)酵罐容器中形 成初始發(fā)酵培養(yǎng)基； (b) 在將嗜硫小紅卵菌的接種物添加至（a)中所述初始發(fā)酵培養(yǎng)基之后，必要時(shí)在發(fā) 酵期間將新鮮量的琥珀酸鹽碳源、氯化銨氮源和磷酸鹽源添加至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的發(fā)酵方法，其包括步驟： (i) 在所述發(fā)酵罐容器中形成溶液4,并使用NaOH調(diào)整pH為5 ; (ii) 校準(zhǔn)pH電極并將所述pH電極和DO電極連接至所述發(fā)酵罐容器； (iii) 將消泡劑的水溶液添加至溶液4 ; (iv) 關(guān)閉發(fā)酵罐并通過(guò)高壓滅菌法滅菌所述培養(yǎng)基； (v) 向所述無(wú)菌培養(yǎng)基添加所述微量成分C〇C12*6H20、NiCl2*6H20、CuC12*2H20、 MnCl2*4H20,ZnS04*7H20,Na2Mo04*2H20,H3B03^PKIit，KH2P04^P K2HP04*3H20的水溶液； (vi) 在攪拌和通氣下將所述琥珀酸鹽溶液和所述消泡溶液連接至進(jìn)給栗； (vii) 在所述發(fā)酵罐內(nèi)確立28°C的溫度并且必要時(shí)使用NaOH和琥珀酸鹽溶液調(diào)整pH 為7 ; (viii) 將嗜硫小紅卵菌的接種物添加至所述發(fā)酵罐； (ix) 將所述磷酸鹽ΚΗ2Ρ04+Κ2ΗΡ0/3Η20的水溶液和所述氯化銨溶液連接至所述進(jìn)給 栗； (X)監(jiān)測(cè)溫度、ΡΗ、氧水平以及氮、碳和磷的供給的同時(shí)繼續(xù)發(fā)酵；和 (xi)繼續(xù)發(fā)酵直至所述容器中的所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積增加至約其全容積。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的發(fā)酵方法，其中步驟（X)中所述溫度維持在最低25°C和最高 31°C;pH的控制上下限為6. 8和7. 3 ;發(fā)酵10-20小時(shí)后氧水平應(yīng)當(dāng)為10%以下；必要時(shí)根 據(jù)所述培養(yǎng)基的分析結(jié)果從外部貯存器添加琥珀酸鹽碳源、氯化銨和磷酸鹽源溶液。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的發(fā)酵方法，其中在發(fā)酵16小時(shí)后和之后每12小時(shí)栗送所述 氯化銨溶液，且在發(fā)酵16小時(shí)后和之后每24小時(shí)栗送所述磷酸鹽溶液。
【專利摘要】提供從嗜硫小紅卵菌生產(chǎn)細(xì)菌葉綠素a(Bchla)的分批補(bǔ)料式發(fā)酵方法，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含無(wú)機(jī)氮化合物作為氮源，并且在發(fā)酵期間，用琥珀酸鹽碳源、無(wú)機(jī)化合物氮源和磷源從連接至發(fā)酵罐容器的外部貯存器補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且在發(fā)酵完成后從分離的細(xì)胞中回收Bchla。
【IPC分類】C12P17/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105358702
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480026085
【發(fā)明人】D·艾倫, N·馬澤爾
【申請(qǐng)人】Tookad Ip有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2014年3月11日
【公告號(hào)】CA2905109A1, EP2971026A1, US20160024542, WO2014140786A1