下述實(shí)施例中的野生型酵母（WT)為多形漢遜酵母Hansenulapolymo巧ha在 文南犬"GermanPerdomo，TobaccoNia2cDNAfunctionallycomplementsaHansenula polymorphayeastmutantlackingnitratereductase.Anewexpressionsystemfor thestudyofplantproteinsinvolvedinnitrateassimilation，2002" 中公開過(guò)，公 眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得。
[0060] 下述實(shí)施例中的pYNR-EX載體在文獻(xiàn)"GermanPerdomo,TobaccoNia2cDNA functionallycomplementsaHansenulapolymorphayeastmutantlackingnitrate reductase.Anewexpressionsystemforthestudyofplantproteinsinvolvedin nitrateassimilation,2002"中公開過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得。
[0061] 實(shí)施例UGeNRTl. 1的獲得
[0062] 一、GeNRTl. 1 的發(fā)現(xiàn) 陽(yáng)06引 1、矮珍珠的總RNA提取及cDNA的合成 W64] 使用TIANGEN公司的RNAprepPurePlant試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書提取矮珍珠 的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 陽(yáng)0化]2、PCR擴(kuò)增
[0066] W步驟1反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用簡(jiǎn)并引物冊(cè)和H3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 PCR產(chǎn)物。引物序列如下：冊(cè):GGNGCNGAYCARTTYGAYG;冊(cè)：AVYTCYTCNACYTGNGTNAC。PCR擴(kuò)增 程序?yàn)椋?5°C預(yù) 5min;94°C變性 30s;52°C退火 30s;72°C延伸lmin，35cycle;72°C，10min。
[0067] 3、電泳及測(cè)序 W側(cè)擴(kuò)增結(jié)束后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物連接到Τ載體，測(cè)序結(jié)果結(jié) 果表明：PCR擴(kuò)增得到一條大小為475bp的條帶（圖1)，其核巧酸序列如序列表中序列1所 示，將其命名為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
[0069]二、3'RACE的獲得
[0070] 1、提取矮珍珠的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA; 陽(yáng)0川 2、套式PCR反應(yīng) W72]W反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA模板，采用引物冊(cè)O(shè)uter:TTATGGACACTATGGACCCTC和 冊(cè)Inner:CCCTTAGCCATCACATTCATG使用TaKaRaLATaq(CodeNo.RR002A)進(jìn)行PCR反應(yīng)， 實(shí)驗(yàn)操作具體如下：
[0073] (1)OuterPCR反應(yīng)
[0074]OuterPCR反應(yīng)體系如表1所示，OuterPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)3min;94°C變性 30s;55°C退火 30s;72°C延伸lmin，20cycle;72°C，10min。
[00巧]表1、OuterPCR反應(yīng)體系
[0076]
陽(yáng)077] PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5~lOil的PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果表明：Outer PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得了大小為8(K)bp的一條帶。
[0078] (2)InnerPCR反應(yīng)
[0079]W上述OuterPCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行InnerPCR反應(yīng)。InnerPCR反應(yīng)體系如表2 所示，InnerPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù) 3min;94°C變性 30s;55°C退火 30s;72°C延伸Imin， 30巧cle;72°C,lOmin。
[0080] PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5~lOi1的PCR反應(yīng)液進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將 PCR產(chǎn)物連接到T載體，挑單克隆，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增得到大小為6巧bp的條帶 (圖2)，即為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的3'序列，其核巧酸序列如序列表中序列2所示。
[0081]表 2、InnerPCR反應(yīng)體系
[0082]
[0083]三5' RACE
[0084] 1、去憐酸化處理
[0085] 使用A化aline化〇3地atase(CIA巧對(duì)TotalRNA中裸露的5'憐酸基團(tuán)進(jìn)行去憐 酸反應(yīng)。具體步驟如下：
[0086] (1)按表3的組份配制去憐酸反應(yīng)液。
[0087] 似0°C反應(yīng)1小時(shí)。
[0088] (3)向上述反應(yīng)液中加入 20μ1 的 3MCHsCOONa(抑5. 2)，130μ1 的RNaseFree (!&0,充分混勻。
[0089] (4)加入200μ1的苯酪/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，充分混勻后13, 000Xg室溫 離屯、5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離屯、管中。
[0090] (5)加入200μ1的氯仿，充分混勻后13, 000Xg室溫離屯、5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移 至新的Microtube中。
[0091] (6)加入2μ1的NACarrier均勻混合，再加入200μ1的異丙醇，充分混勻后，冰 上冷卻10分鐘。
[0092] (7)13,000Xg 4°C離屯、20分鐘，棄上清。加入500μ1的70%冷乙醇（RNase化ee 地2〇配制）漂洗，13, 000Xg，4°C離屯、5分鐘，棄上清后干燥。
[0093] (8)加 7μ1 的RNaseFree地2〇溶解沉淀，得到CIAP-treatedRNA。
[0094] 表3、去憐酸反應(yīng)液 陽(yáng)0巧]
[0096] 2、"去帽子"反應(yīng)
[0097] 使用TobaccoAcidPyro地OS地atase(TAP)去掉mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個(gè) 憐酸基團(tuán)。
[009引（1)按表4的組份配制"去帽子"反應(yīng)液。
[0099] 表4、"去帽子"反應(yīng)液 陽(yáng)100]
[0101] 似37°C反應(yīng)1小時(shí)。取5μ1用于5'RACEAdaptor連接反應(yīng)，剩余的保存 于-80°C。 陽(yáng)10引3、5'RACEAdaptor的連接 陽(yáng)103] (1)配制如下溶液：CIAP/TAP-treatedRNA5μ1、5'RACEAdaptor(15μΜ) 1μ1、 RNase化eed&0 4μ1，混勻。
[0104]似65 °C保溫5分鐘后冰上放置2分鐘，然后加入下列試劑。RNase Inhibitor(40U/yμ1、5XRNALigationBuffer8μ1、40 %PEG#600020μ1、RNA Ligase(40U/yl)lyl。
[0105] (3)16°(：反應(yīng)1小時(shí)。
[0106] (4)加入 20μ1 3MCHsCOONa(抑5. 2)，140μ1RNase化ee地2〇,充分混勻后再加 入200μ1苯酪/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，混勻，13, 000Xg室溫離屯、5分鐘，將上層水相 轉(zhuǎn)移至新的Microtube中。 陽(yáng)107] (5)加入200μ1的氯仿，混勻，13, 000Xg室溫罔心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新 的Microtube中。 陽(yáng)108] (6)加入2 μ 1的NA Carrier后均勻混合加入200 μ 1的異丙醇，充分混勻后，冰上 冷卻10分鐘。 陽(yáng)109] (7) 13,000Xg 4°C離屯、20分鐘，棄上清。加入500μ1的70%冷乙醇（RNase化ee 地2〇配制）漂洗，13, OOOXg 4°C離屯、5分鐘，棄上清，干燥。 陽(yáng)110]做加入6 μ 1的RNase化ee地2〇溶解沉淀，得到LigatedRNA。 陽(yáng)111] 4、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0112] (1)按表5的組份配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
[0113] 表5、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 陽(yáng)114]
陽(yáng)1巧]似反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：30°ClOmin;42°C比；70°C15min。
[0116] (3)反應(yīng)結(jié)束后可W進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，或?qū)⒎磻?yīng)液保存于-20°C。
[0117] 5、0uterPCR擴(kuò)增
[0118]OuterPCR擴(kuò)增體系如表6所示，OuterPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 °C預(yù)3min;94°C變性 30s;55°C退火 30s;72°C延伸lmin，30cycle;72°C，10min。
[0119]PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5~lOi1的PCR反應(yīng)液進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將 PCR產(chǎn)物連接到T載體，挑單克隆，測(cè)序。
[0120]測(cè)序結(jié)果：PCR擴(kuò)增得到大小為1057bp的條帶（圖3)，即為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 的5'序列，其核巧酸序列如序列表中序列3所示。 陽(yáng)121]表6、Outer PCR擴(kuò)增體系 陽(yáng)1。]
陽(yáng)12引 四、GeNRTl. 1基因的克隆
[0124] 根據(jù)上述步驟二和步驟Ξ獲得的3'RACE和5'RACE的核巧酸序列，設(shè)計(jì)了如下引 物：冊(cè)(GTCGACATGGCTGATATAGAAGGCT)和冊(cè)(ACTAGTTCAAACTCGAGACGGTGTC)，W上述步驟一 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將其連接到PMD18-T，挑單克 隆，測(cè)序。
[01巧]測(cè)序結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到了大小為1440bp的條