帶，其核巧酸序列如序列表中 序列4所示，將序列4所示的基因命名為GeNRTl. 1基因，自5'端1-1440位為0RF，GeNRTl. 1 基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。 陽1%] 實施例2、GeNRTl. 1基因功能的驗證
[0127] 本實施例利用Δ ynt-Leu雙突變多形漢遜酵母來驗證GeNRTl. 1基因的功能。
[0128] 一、轉(zhuǎn)GeNRTl. 1酵母的構建
[0129] 1、穿梭質(zhì)粒的構建
[0130] 將序列表中序列4所示的DNA分子插入pYNR-EX載體的spe I和sal I酶切位點 間，且保持pYNR-EX載體的其他序列不變，得到重組載體pYNR-GeNRTl. 1。 陽131] 2、線性化
[0132]將pYNR-GeNRTl. 1用Bs化I酶切線性化，得到線性化的pYNR-GeNRTl. 1，1%瓊脂 糖凝膠電泳（圖4)，回收純化目標產(chǎn)物，使用分光光度計進行定量，備用。 陽133] 3、雙突變多形漢遜酵母（Δynt-Leu)感受態(tài)細胞的制備
[0134] ①挑取Δynt-Leu雙突變多形漢遜酵母單菌落，接種至5mLYGNH培養(yǎng)基化17% (w/v)酵母氮源基礎-無氨基酸無硫酸錠值ifco)，2%葡萄糖度iodee)，5mMNH4CI(福臣 化學））中，37°C、200r/min培養(yǎng)過夜，得到培養(yǎng)液。
[0135]②取100μL上述培養(yǎng)液接種至100血YGNH培養(yǎng)基中，37°C、200r/min，培養(yǎng) 14-16h，使菌液濃度達到0D6001. 3~1. 5。
[0136] ③將上述菌液轉(zhuǎn)入預冷的50血無菌用離屯、管中，4°C，120化/min離屯、5min，收集 菌體。
[0137] ④將收集的菌體分別用和預冷的無菌水重懸各清洗一次。
[0138]⑥用2血的冰預冷的Imol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，得到Δ ynt-Leu雙突 變多形漢遜酵母感受態(tài)細胞，分裝-80°C備用。 陽139] 4、轉(zhuǎn)化 陽140]①將線性化的pYNR-GeNRTl. 1加入80 μ L Δ ynt-Leu雙突變多形漢遜酵母感受態(tài) 細胞中，混勻，冰浴5min后移入冰冷的電轉(zhuǎn)杯中。 陽141] ②電轉(zhuǎn)儀預熱后，設定參數(shù)，150v、130 Ω，電擊。
[0142] ③電擊后，加入600μ1冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1. 5mL的EP管中， 37°C靜置培養(yǎng)比。 陽143] ④將菌液涂布于含氨節(jié)抗性的YNGH平板上，37 °C培養(yǎng)3~4d至有單克隆。 陽144] 5、轉(zhuǎn)GeNRTl. 1酵母陽性株的篩選
[0145] 挑單菌落，采用實施例1中的冊和冊為引物，利用PCR篩選酵母陽性克隆。PCR擴 增程序：95°C預 3min;94°C變性 30s;57°C退火 30s;72°C延伸lmin，30cycle;72°C，10min。
[0146] PCR反應結(jié)束后，將PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增得到大小 為1440bp的條帶（圖5)，即為轉(zhuǎn)GeNRTl. 1酵母陽性株，將其命名為Δ ynt-GeNRTl. 1。
[0147] 二、GeNRTl. 1蛋白的功能驗證
[0148] 1、為了驗證GeNRTl. 1蛋白具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的功能，分別挑取Δynt-Leu雙突 變多形漢遜酵母、野生型酵母（WT)和轉(zhuǎn)GeNRTl. 1酵母（Δynt-GeNRTl. 1)單菌落，接種到 lOmLYN化培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)過夜，利用分光光度計測量0D600的吸光值。
[0149] 結(jié)果如圖6所示：Δ ynt-Leu雙突變多形漢遜酵母在YMiL培養(yǎng)基中不能生長，而 野生型酵母和轉(zhuǎn)GeNRTl. 1酵母在YMiL培養(yǎng)基中可W正常生長，表明GeNRTl. 1蛋白可W使 Δ ynt-Leu恢復生長，具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的功能。 陽150] 2、吸收速率的測定 陽15U 硝酸根離子在紫外區(qū)有強烈的吸收，利用它在220nm波長處的吸光度可定量測定 硝酸鹽的濃度。雖然溶解在溶液中的有機物在220nm處也會有吸收，但硝酸根離子在275nm處沒有吸收。因此，在275nm處作另一次測量，W校正硝酸鹽氮值。A校=A220-2A275。根 據(jù)文獻報道，通過測定硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的硝酸鹽吸收效率Km，可W來判定該蛋白是高親和 還是低親和轉(zhuǎn)運蛋白。當Km<1000uM為高親和轉(zhuǎn)運蛋白；當Km〉1000uM為低親和轉(zhuǎn)運蛋白。 [0152]①挑取Δynt-GeNRTl. 1酵母單菌落，接種至5血YGNH培養(yǎng)基中，37°C、200r/min 培養(yǎng)過夜，得到培養(yǎng)液。 陽15引 ②取lOOiL上述培養(yǎng)液接種至100血YGNH培養(yǎng)基中，37°C、200r/min，培養(yǎng) 14-16h，使菌液濃度達到0D6001. 3~1. 5,4°C，1200r/min離屯、5min，收集菌體備用。
[0154] ③取6個50血的離屯、管中加入10血YG培養(yǎng)基化17% (w/v)酵母氮源基礎-無 氨基酸無硫酸錠值ifco)，2%葡萄糖度iodee))，每管中分別加入lOOmg酵母細胞，震蕩培 養(yǎng)化，W使每管中的酵母處于相同的生長狀態(tài)。 陽巧日]④4°C，120化/min離屯、5min，棄上清，將各管的酵母菌體分別用50mL冰冷的含有 50μM、100μM、300μM、500μM、μM、1000μM、1500μΜ硝酸鹽的YG培養(yǎng)基重懸，沖洗一遍。 陽156] ⑥重復④兩次。 陽157] ⑧將上述各管分別加入含有相應硝酸鹽濃度的YG培養(yǎng)基lOmL，37°C振蕩培養(yǎng)30 分鐘后測定吸光度，繪制吸收速率曲線，并計算Km值。
[0158] 吸收速率曲線如圖7所示：從圖中可W看出：GeNRTl.1蛋白的Km值為1800μΜ，大 于1000μΜ，說明本發(fā)明的GeNRTl.1蛋白是一個低親和的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，具有提高硝酸 鹽吸收效率的功能。
【主權項】
1. 蛋白質(zhì)，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)： a) 氣基酸序列是序列表中序列5所不的蛋白質(zhì)； b) 在序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)； c) 將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。2. 與權利要求1所述的蛋白質(zhì)相關的生物材料，為下述A1)至A12)中的任一種： A1)編碼權利要求1所述的蛋白質(zhì)的核酸分子； A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒； A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體； A4)含有A2)所述表達盒的重組載體； A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物； A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物； A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物； A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物； A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A10)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系。3. 根據(jù)權利要求2所述的相關生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子為如下1)或 2)或3)所示的基因： 1) 其編碼序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權利要求1所述的蛋 白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1所述的蛋白質(zhì) 的cDNA分子或基因組DNA分子。4. 權利要求1所述的蛋白質(zhì)或權利要求2或3所述的相關生物材料在轉(zhuǎn)運硝酸鹽中的 應用。5. 權利要求1所述的蛋白質(zhì)或權利要求2或3所述的相關生物材料在提高硝酸鹽吸收 效率中的應用。6. 權利要求1所述的蛋白質(zhì)或權利要求2或3所述的相關生物材料在培育硝酸鹽轉(zhuǎn)運 功能提尚的轉(zhuǎn)基因酵母中的應用。7. -種培育硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能提高的轉(zhuǎn)基因酵母的方法，包括將權利要求1所述的蛋白 質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w酵母中，得到轉(zhuǎn)基因酵母的步驟；所述轉(zhuǎn)基因酵母的硝酸鹽轉(zhuǎn)化能 力高于受體酵母。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于：所述權利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基 因為序列表中序列4所示的DNA分子。9. 根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述受體酵母為Λynt-Leu雙突變 多形漢遜酵母。
【專利摘要】本發(fā)明公開了速生水生植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白GeNRT1.1及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。通過試驗證明：GeNRT1.1蛋白具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的功能，能提高植物的氮素利用效率，使植物快速生長。
【IPC分類】C12N15/81, C07K14/415, C12R1/78, C12N15/29
【公開號】CN105367642
【申請?zhí)枴緾N201510917196
【發(fā)明人】劉昱輝, 師雙鋒, 李梅, 董航
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月10日