一種產(chǎn)酸屎腸球菌、抑菌微生態(tài)制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明設(shè)及一種產(chǎn)酸尿腸球菌、抑菌微生態(tài)制劑 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)調(diào)整，規(guī)?；?、集團(tuán)化養(yǎng)殖已成為發(fā)展趨勢(shì)，養(yǎng)殖戶為了追 求經(jīng)濟(jì)效益最大化，在飼料中添加飼用抗生素、激素及益生菌制劑等，W達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物增重 和快速生長(zhǎng)的目的。但是添加促生長(zhǎng)飼用抗生素等藥物會(huì)使致病菌的耐藥性越來越普遍、 耐藥譜越來越廣，由此引起動(dòng)物疫病越來越難W控制，形成惡性循環(huán)，不但影響畜牧養(yǎng)殖業(yè) 的可持續(xù)發(fā)展，還會(huì)造成畜禽類產(chǎn)品中殘留抗生素和激素的嚴(yán)重超標(biāo)，直接影響到人類的 身體健康。
[0003] 細(xì)菌素是由某些細(xì)菌通過基因編碼、核糖體合成的具有抑菌生物活性的蛋白或膚 類。細(xì)菌素與抗生素在生物合成、作用機(jī)制、抑菌譜等方面明顯不同，細(xì)菌素可W安全、有效 地使用已達(dá)到控制目標(biāo)病原微生物生長(zhǎng)的目的。乳酸菌為人類和動(dòng)物腸道主要菌群，在動(dòng) 物腸道內(nèi)可W分泌出乳酸，降低動(dòng)物腸道的抑值，常用于人和動(dòng)物益生菌產(chǎn)品。
[0004] 枯草芽抱桿菌不是腸道的常住菌，只屬于過路菌，不會(huì)在腸道內(nèi)長(zhǎng)期定植與生長(zhǎng)， 它會(huì)隨著食物進(jìn)入胃腸道，最終又與糞便一起排出體外。若直接添加由枯草芽抱桿菌，由于 其在動(dòng)物腸道內(nèi)停留時(shí)間短，其代謝產(chǎn)物--細(xì)菌素還未合成或合成量較少，無法充分發(fā)揮 抑菌作用。
[0005] 本發(fā)明將枯草芽抱桿菌在體外進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌素，并將其與乳酸菌進(jìn)行 協(xié)同組合，制備出高效抑菌的微生態(tài)制劑。該微生態(tài)制劑進(jìn)入動(dòng)物胃腸道后可快速發(fā)揮抑 菌作用，有效調(diào)節(jié)胃腸道的微生態(tài)平衡，維護(hù)動(dòng)物健康。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)酸尿腸球菌及其抑菌微生態(tài)制劑，其具有高效抑菌 的能力。
[0007] 本發(fā)明的另一目的提供上述產(chǎn)酸尿腸球菌及其抑菌微生態(tài)制劑的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明提供的產(chǎn)酸尿腸球菌CE001巧nterococ州S faecium)，其菌種保藏編號(hào)為： CGMCCNO. 9666。本發(fā)明的尿腸球菌，具有良好的產(chǎn)酸性能。
[0009] 本發(fā)明的抑菌微生態(tài)制劑，包括枯草芽抱桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素和本發(fā)明上述的產(chǎn)酸尿 腸球菌；所述細(xì)菌素與尿腸球菌的比例為Ig細(xì)菌素比2~5億尿腸球菌活菌數(shù)。
[0010] 本發(fā)明所使用的枯草芽抱桿菌可W是現(xiàn)有的細(xì)菌素的任意菌株，尤其優(yōu)選的， 本發(fā)明所述枯草芽抱桿菌選用購自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、，其保藏號(hào)為ACCC 10619的菌株。
[0011] 本發(fā)明的上述抑菌微生態(tài)制劑的制備方法，包括W下步驟：
[0012] 1)將制備的枯草芽抱桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素按比例加入到發(fā)酵后期的尿腸球菌發(fā)酵液 中，攬拌混合均勻；
[0013] 2)將混合后的發(fā)酵液固液分離獲得菌泥，在菌泥中加入干燥保護(hù)劑，所述菌泥與 干燥保護(hù)劑的質(zhì)量體積比（g/L)為5%~25%，采用制粒、凍干或噴霧干燥制成抑菌微生態(tài) 制劑。
[0014] 進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述細(xì)菌素的制備包括W下步驟：
[0015] 1)將枯草芽抱桿菌菌株接種到發(fā)酵用培養(yǎng)液中，在37~39°C條件下，培養(yǎng)48~ 50h，得到發(fā)酵液；
[0016] 2)將發(fā)酵液經(jīng)5000~1200化/m離屯、5-30min中取上清液，在上清液中緩慢加入 硫酸錠固體粉末進(jìn)行鹽析，邊加邊攬拌，直到飽和度達(dá)20~80%，然后在4~5°C條件下靜 置4~化，再在2~10°C條件下、W5000~12000r/m轉(zhuǎn)速離屯、10~30min，棄去上清液得 到細(xì)菌素。
[0017] 本發(fā)明所述的枯草芽抱桿菌菌株發(fā)酵用培養(yǎng)液可W使用本領(lǐng)域公知的任意用于 枯草芽抱桿菌的培養(yǎng)液，優(yōu)選地，所用培養(yǎng)液包含（重量比）：玉米粉0.5%~3. 5%、豆餅 粉1. 0 %~5. 0 %、魚粉0. 01 %~0. 5 %、葡萄糖0. 2 %~2. 0 %、碳酸巧0. 5 %~5. 0 %、 硫酸錠0. 001 %~0. 2 %、憐酸氨二鐘0. 001 %~0. 2 %、硫酸儀0. 001 %~0. 2 %、硫酸儘 0. 001%~0. 2%，純凈水 1 升，pH為 7. 0 ~7. 5。
[0018] 所述的細(xì)菌素的活力單位可達(dá)17361. 68U/mg，可抑制多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽 性病原菌。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述尿腸球菌發(fā)酵液的制備方法包括W下步驟：
[0020] 1)在種子培養(yǎng)基中，35~45°C有氧或兼性條件下培養(yǎng)尿腸球菌18~24小時(shí)，成 為一級(jí)種子；
[0021] 2)將一級(jí)種子液接種在種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在35~45Γ有氧或兼性條件下 培養(yǎng)18~24小時(shí)，成為二級(jí)種子；
[0022] 3)將獲得的二級(jí)種子液接種在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在30~45Γ有氧或兼性 條件下，采用定時(shí)或連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵方式培養(yǎng)18~36小時(shí)；
[0023] 作為優(yōu)選地，步驟1)和2)使用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基。
[0024] 作為優(yōu)選地，步驟3)發(fā)酵采用改良的MRS培養(yǎng)基，所述改良的MRS培養(yǎng)基是在每 升MRS培養(yǎng)基中加有大豆蛋白腺5~30g，葡萄糖1~lOg，酵母粉1~lOg，乙酸鋼1~ 10邑，巧樣酸二胺0. 1~8g，TweenSOO. 1~5g，憐酸氨二鐘0. 1~5g，硫酸儀0. 05~Ig，硫 酸車孟0. 001~0. 2g，碳酸巧1~30g，純凈水1升，調(diào)節(jié)抑值至5. 5~7. 5。
[00巧]本發(fā)明還提供了所述產(chǎn)酸尿腸球菌W及抑菌微生態(tài)制劑的應(yīng)用，尤其是在抑菌和 飼料添加劑方面的應(yīng)用。
[0026]申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)枯草芽抱桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在酸性條件下其抑菌能力會(huì)顯著提 升。本發(fā)明將細(xì)菌素與高產(chǎn)乳酸的尿腸球菌有機(jī)配合，使其發(fā)揮協(xié)同作用。尿腸球菌產(chǎn)生 乳酸造成動(dòng)物腸道內(nèi)的酸性環(huán)境，細(xì)菌素在此酸性環(huán)境中抑菌能力大幅提升，殺滅病原菌， 反過來又能促進(jìn)尿腸球菌在動(dòng)物腸道內(nèi)的定植，補(bǔ)充腸道正常菌群，提高免疫能力，減少在 畜禽養(yǎng)殖中抗生素的使用，促進(jìn)畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。
【附圖說明】
[0027] 圖1是本發(fā)明的尿腸球菌巧nterococcus faecium)菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形 成的菌落。
[0028] 圖2是本發(fā)明的細(xì)菌素抑菌活性檢測(cè)的牛津杯平板示意圖，其中甜表示高劑量樣 品溶液，化表示低劑量樣品溶液，BH表示高劑量標(biāo)準(zhǔn)溶液，化表示低劑量標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0029] 圖3是本發(fā)明細(xì)菌素在不同抑值條件下的抑菌活性比較（實(shí)施例3表6組別1)。
[0030] 圖4是本發(fā)明微生態(tài)制劑與單一細(xì)菌素、單一枯草芽抱桿菌W及枯草芽抱桿菌與 尿腸球菌的復(fù)合微生態(tài)制劑在相同濃度下的抑菌活性比較。
[0031] 本發(fā)明的尿腸球菌CE001巧nterococ州S faecium)已于2014年9月16日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中 國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNO. 9666。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034] 下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如無特殊說明配方如下：
[0035]MRS培養(yǎng)基：
[0036] 蛋白腺lOg，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐溫80ml，憐酸氨二鐘2g，乙酸鋼5g，巧樣酸 Ξ氨2g，屯水硫酸儀0. 2g，一水硫酸儘0. 05g，酵母粉4g，用蒸饋水定容至1L。
[0037] MRS瓊脂培養(yǎng)基： 陽03引 1LMRS培養(yǎng)基中加瓊脂15邑。
[0039] 實(shí)施例1尿腸球菌巧nterococcus faecium)的分離及鑒定
[0040]( 一）尿腸球菌巧nterococcus faecium)的分離與純化
[0041] 1. 1菌株的分離培養(yǎng)
[0042] 將健康雞致死、解剖后，分別用無菌方法取小腸黏膜和腸內(nèi)容物各Ig，加入裝有 9血滅菌生理鹽水的小瓶中，混勻后進(jìn)行倍比稀釋，取10 4、10 5、10 6稀釋度的混懸液100m L分別滴加到3個(gè)MRS固體培養(yǎng)基上，用玻璃棒涂抹均勻，然后于37°C厭氧和需氧培