養(yǎng) 4她，觀察菌落形態(tài)及是否有溶巧環(huán)。挑選有溶巧環(huán)的乳酸菌菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基 中，進(jìn)行劃線分離純化。觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4Γ冰箱膽藏備用。 陽0創(chuàng) 1.2革蘭氏染色
[0044] 用無菌注射器吸取少量MRS肉湯培養(yǎng)物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘 干固定。滴加結(jié)晶紫染色液，染30s，水洗；滴加革蘭氏艦液媒染，作用Imin，水洗；滴加丙酬 乙醇混合液（丙酬：95%乙醇=3:7)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復(fù)染Imin，水洗，待 干，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體呈紅色為陰性，紫色的為陽性。呈革蘭氏陽性形態(tài)一致 的球菌，進(jìn)一步進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)。 W45] 1. 3接觸酶實(shí)驗(yàn)
[0046] 做MRS斜面培養(yǎng)基，取培養(yǎng)物0. 注入裝有MRS瓊脂培養(yǎng)基斜面，5 %C〇2培養(yǎng) 箱，37°C培養(yǎng)2地，長出菌落后，將3%過氧化氨溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產(chǎn)生說明是 陰性，若有氣泡產(chǎn)生說明是陽性。通過MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)物經(jīng)過革蘭氏染色陽性 和接觸酶實(shí)驗(yàn)陰性可初步認(rèn)為是乳酸菌屬化actobacillus)。
[0047] 動(dòng)物腸道樣品經(jīng)分離純化，結(jié)合革蘭氏染色和接觸酶實(shí)驗(yàn)共分離出5株乳酸球菌 分別命名為YB-1、YB-2、YB-3、YB-4、YB-5。
[0048](二）產(chǎn)酸菌株篩選研究 W例將上述篩選的5株待測菌株按2 % (v/v)的接種量接種到5mLMRS液體培養(yǎng)基中， 37°C厭氧發(fā)酵24h后檢測發(fā)酵液離屯、上清的抑值及乳酸含量。結(jié)果見表1。YB-5乳酸菌 株的產(chǎn)酸量高于其余菌株，表明該株乳酸菌具有良好的產(chǎn)酸性能。
[0050] 表1乳酸菌發(fā)酵液的抑及其發(fā)酵液中乳酸含量（mg/L)
[0051]
陽化引（Ξ)基因組DNA提取及16SrRNA測序 陽化引16S rRNA基因序列分析：上述YB-5細(xì)菌總DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA提取 試劑盒（天根生化（北京）科技有限公司，Tiangen DP302-02)提取。16S rRNA基因擴(kuò)增 引物采用細(xì)菌通用引物，其引物序列為：正向引物為27F(對(duì)應(yīng)于Escherichia coil 8-27 位堿基）：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'；反向引物為1495R(對(duì)應(yīng)于Escherichia coil 1495-1515位堿基）：5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。反應(yīng)體系（50 μ L)如表2所示： [0054]表2 PCR擴(kuò)增體系 陽化引
[0056] PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min;94°C變性Imin;58°C退火Imin;72°C延伸 2min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段 長度約1500bp的陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后送眷博興科生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行序列測定， YB-5細(xì)菌的16S rRNA的編碼基因的核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0057] 得到的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST化ttp://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi)同源性比對(duì)。鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)YB-5與尿腸球菌巧nterococcusfaecium)的 同源性為99%，確定為化terococ州Sfaecium。菌株于2014年9月16日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo. 9666,其分類命名為尿 腸球菌CE001 巧nterococ州Sfaecium)。
[0058] 尿腸球菌CE001巧nterococ州Sfaecium)(CGMCCNo.9666)的細(xì)胞為球狀，革蘭氏 染色陽性，其它生物學(xué)特性如表3所示。該尿腸球菌巧nterococcus faecium),是腸球菌屬 (Enterococcus sp.)的一種。
[0059] 表3尿腸球菌的生物學(xué)特性
[0060]
[0061] 實(shí)施例2枯草芽抱桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的制備
[0062] (1)W0. 5%的接種量將枯草芽抱桿菌菌種接種于發(fā)酵罐中，采用常規(guī)方法在培 養(yǎng)基上于37°C、150轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)50h，得到發(fā)酵液。所述培養(yǎng)基包含（重量比）：玉 米粉0.5%、豆餅粉3%、魚粉0. 1 %、葡萄糖1.0%、碳酸巧1.59%、硫酸錠0.05%、憐酸氨 二鐘0. 01 %、硫酸儀0. 01 %、硫酸儘0. 01 %，純凈水1升，抑為7. 0~7. 5 ;
[0063] (2)發(fā)酵液經(jīng)1000化/m離屯、20min后取上清液，在上清液中緩慢加入硫酸錠固體 粉末進(jìn)行鹽析，邊加邊攬拌，直到飽和度達(dá)80 %，然后在4°C條件下靜置12h，再在5°C條件 下、12000;r/m、離屯、30min，棄去上清液得到細(xì)菌素。
[0064] 實(shí)施例3細(xì)菌素抗菌的性能檢測 柳尉（一）細(xì)菌素的抑菌譜
[0066]取Ig制得的細(xì)菌素沉淀分別加入5、10、20血營養(yǎng)肉湯中，制成3個(gè)含不同細(xì) 菌素濃度的營養(yǎng)肉湯（20%、10%、5% )，W不含有細(xì)菌素的營養(yǎng)肉湯作為對(duì)照，分別接 種傷寒沙口氏菌（Salmonellaty地i，CVCC2212,國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中屯、）、金黃 色葡萄球菌（Staphylococ州Saureus，CVCC1882,國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中屯、）、大 腸桿菌K88(EscherichiaColi，CMCC44742,中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中屯、）和大腸桿菌 0157巧scherichiaColi，購自中國獸藥監(jiān)察所），接種量為培養(yǎng)液的5 %，置37°C，5%C〇2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
[0067] 檢測每組培養(yǎng)物的菌落數(shù)，結(jié)果見表4。
[0068] 表4抑菌培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
[0069]
[0070] 從表中可W看出，在不同濃度下枯草芽抱桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)傷寒沙口氏菌、金 黃色葡萄球菌W及兩株大腸桿菌均有良好的抑制效果，可W使其活菌數(shù)下降4-5個(gè)數(shù)量 級(jí)。
[0071](二）細(xì)菌素的抑菌活性檢測 陽072] 取Ig細(xì)菌素沉淀溶于20血0. 02mol/L的乙酸鋼緩沖液（P冊(cè).5)。采用牛津杯法 檢測其抑菌活性。抑菌活性分析方法：
[0073] (1)準(zhǔn)確稱取硫酸粘桿菌素標(biāo)準(zhǔn)品0. 〇360g，用憐酸緩沖液定容至lOmL，2000巧m， 離屯、lOmin后再稀釋10倍作為高劑量濃度，并將高劑量濃度再稀釋1倍，使之配成高低劑 量兩個(gè)濃度梯度溶液；
[0074] (2)將10血素瓊脂平鋪于培養(yǎng)皿（直徑90mm，深20mm)中，置于水平臺(tái)面上靜置 凝固；
[0075] (3)取稀釋至約107c化/mL的新鮮培養(yǎng)的指示菌一大腸桿菌巧scherichia coli)100yL與融化并至保溫至55°C的LB固體培養(yǎng)基（約10血）混勻，傾倒于平板中。輕 放于水平操作臺(tái)上至冷卻，保證瓊脂膠凝后培養(yǎng)基平面的平整度；
[0076] (4)將牛津杯用無菌綴子輕輕放置于平板上，將200μL細(xì)菌素溶液加入牛津杯 后，在4~5°C條件下靜置12h，隨后37°C培養(yǎng)24h后將平板取出，倒出牛津杯，將平板放置 在一個(gè)黑色背景的平臺(tái)上，用游標(biāo)卡尺測量各抑菌圈的大小，取其平均值，按公式（1)計(jì)算 效價(jià)。
[0077]
U)
[0078]式中：
[0079]CsH--樣品溶液的效價(jià)，單位為U/mg;
[0080]Cbh--標(biāo)準(zhǔn)溶液的效價(jià)，單位為U/mg;
[00川 Xsw-一高劑量樣品溶液所致的抑菌圈直徑，單位為毫米（mm);
[00間 XsL-一低劑量樣品溶液所致的抑菌圈直徑，單位為毫米（mm);
[008引 Χβη-一高劑量標(biāo)準(zhǔn)溶液所致的抑菌圈直徑，單位為毫米（mm);
[0084] Xbl一一低劑量標(biāo)準(zhǔn)溶液所致的抑菌圈直徑，單位為毫米（mm);
[00化]k--高劑量倍數(shù)與低劑量倍數(shù)的比值。
[0086] 本實(shí)施例中Cw為22782U/mg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5,經(jīng)檢測枯草芽抱桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素 效價(jià)為 17361. 68U/mg。
[0087] 表5抑菌圈測量結(jié)果（mm)
[0088]
[0089] (Ξ)細(xì)菌素的抑菌活性隨抑值變化情況
[0090] 取Ig細(xì)菌素沉淀溶于20血0