小反芻獸疫病毒通用/強毒雙重熒光定量rt-pcr檢測試劑、檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明設及一種小反當獸疫病毒通用/強毒雙重巧光定量RT-PCR檢測試劑、檢測 試劑盒及檢測方法，屬于動物檢疫技術領域。
【背景技術】
[0002] 小反當獸疫被世界動物衛(wèi)生組織（0IE)規(guī)定必須申報的動物傳染病，在我國《法 定動物疫病病種名錄》中規(guī)定為一類動物疫病，屬于危害嚴重，需要采取緊急嚴厲的強制預 防，控制和撲滅的動物疫病之一。小反當獸疫具有高發(fā)病率和高死亡率等特點，發(fā)病率可達 至IJ100%，死亡率50%~90%，嚴重爆發(fā)時死亡率甚至100%，屬于危害嚴重，需嚴厲防控 的重大動物傳染病之一。該病一旦發(fā)生將給小反當動物（山羊、綿羊）飼養(yǎng)國家的內(nèi)外貿(mào)經(jīng) 濟帶來巨大的損失。
[0003] 2007年7月8日國家外來動物疫病診斷中屯、接到西藏阿里地區(qū)發(fā)生不明山羊疫病 的報告并收到采集的樣品。病羊主要癥狀：眼炎，甚至失明；漿液性和脈性鼻液：體溫高達 40-4rC:嚴重腹瀉。剖檢變化：肺炎變化、支氣管和肺臟出現(xiàn)干酪樣病灶.肺臟表面、支 氣管黏膜、腎臟、腸系膜等有出血點。綿羊很少發(fā)病。國家外來動物疫病診斷中屯、接到樣品 后即啟動病原學和血清學檢測，結果表明本次疫情由小反當獸疫病毒引起，運是我國歷史 上首次爆發(fā)小反當獸疫。
[0004]自西藏爆發(fā)小反當獸疫W來，新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、安徽、重慶、迂寧、山東、湖 南等地相繼爆發(fā)，給我國的養(yǎng)羊業(yè)造成重大損失，農(nóng)業(yè)部出臺防控措施，嚴防疫情的蔓延。 防控小反當獸疫的措施之一是早發(fā)現(xiàn)、早診斷，要做到運點，需要快速靈敏的檢測方法。
[0005]目前新型的核酸擴增檢測方法發(fā)展快速，由于其簡便快捷，結果準確，已經(jīng)在臨床 檢疫中廣泛應用，取得了良好的效果，已有替代傳統(tǒng)檢測方法的趨勢。盡管在小反當獸疫 暴發(fā)后，國內(nèi)外很多學者研究建立了巧光RT-PCR檢測方法，但是小反當獸疫通用/強毒雙 重巧光定量RT-PCR檢測方法還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是建立同時檢測小反當獸疫病毒和強毒的雙重巧光定量RT-PCR檢 測試劑及雙重巧光RT-PCR檢測方法，為快速鑒別強毒與疫苗毒提供一種簡便方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術方案： 一種小反當獸疫病毒通用/強毒雙重巧光定量RT-PCR檢測試劑，含有 通用-上游引物：5'GCCAACYGCTYCYGGARATCA3'，如沈QIDNO. 1 所示， 通用-下游引物：5'ATRGCYTGCAGCCTGAAGA3'，如沈QIDNO. 2 所示， 通用-探針：5,FAM-CCCTCGTGAGGCYCARAGRTCGGC-TMARA3，，如沈QIDNO. 3 所示； 強毒-上游引物：ATCCTGGATAGAGAACGCTTGGTC，如沈QIDNO. 4 所示， 強毒-下游引物：GCYCGGTGAAGCCTGATC，如沈QIDNO. 5所示， 強毒-探針：5' 肥X-CCAGCAGYCCGATTAGACTCAGRAACA-TAMRA3'，如沈QIDNO. 6 所示。
[0008] -種小反當獸疫病毒通用/強毒雙重巧光定量RT-PCR檢測試劑，由巧光RT-PCR 反應液和酶混合物按照15:1的體積比組成； 巧光RT-PCR反應液：由1體積濃度為10ymol/L的通用-上游引物、1體積濃度為 10ymol/L的通用-下游引物、0. 5體積濃度為10ymol/L的通用-探針、1. 25體積濃度為 10ymol/L的強毒-上游引物、1. 25體積濃度為10ymol/L的強毒-下游引物、0. 75體積 濃度為10μmol/L的強毒-探針、3體積5xRT、1. 5體積10XPCR、1. 5體積濃度為25mmol/L 的MgCl2、2體積濃度為2. 5mmol/L的dNTP和1. 25體積DEPC水組成； 所述酶混合物由200υ/μL的M-MLV反轉錄酶、5υ/μL的化qDNA聚合酶、40υ/μL的RNA酶抑制劑按2:1:1的體積比混合而成。
[0009] 所述DEPC水：自來水兩次蒸饋，經(jīng)過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收 取電阻率>18.0MQ.cm的水，得Millipore-Q純化水；然后向Millipore-Q純化水中加 入DEPC至終濃度為0. 1%，37°C攬拌處理12虹，15化f7in2 (1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌 15分鐘，即可。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種含有上述小反當獸疫病毒通用/強毒雙重巧光定量RT-PCR 檢測試劑的試劑盒。
[0011] 上述試劑盒，還含有陰性對照、陽性對照和DEPC水； 所述陰性對照：未感染小反當獸疫病毒的組織樣品（小反當獸疫病毒陰性組織樣品)， 用0.Olmol/L抑7. 2PBS緩沖鹽水制成20%懸液，70°C作用1小時，提取RNA。
[0012]陽性對照：為體外轉錄的、包含N基因和Η基因的非感染性RNA片段。（通用檢測 方法的祀?yún)^(qū)域為Ν基因，強毒檢測方法的祀?yún)^(qū)域為Η基因） 本發(fā)明還提供了一種采用上述小反當獸疫病毒通用/強毒雙重巧光定量RT-PCR檢測 試劑、檢測試劑盒的檢測方法， (1) 向15μΙ巧光RT-PCR反應液中加入lOul待測樣品的RNA，配成25ul的反應體系， 取lOul陽性對照、陰性對照的RNA，分別加入到15μL巧光RT-PCR反應液中，作為陽、陰性 對照，進行巧光定量PCR反應； (2) 巧光定量PCR的反應參數(shù)如下設置： 第一階段：預變性，42°C/30min; 第二階段：92°C/3min; 第Ξ階段：94°C/15sec，54°C/25sec，60°C35sec,共 40 個循環(huán)； 巧光收集在第Ξ階段每次循環(huán)的60°C延伸時進行； (3) 結果讀?。簩τ诙嗤ǖ繮CR儀，利用FAM(465-510)通道和肥X(VIC) (533-580) 讀取結果；對于ABI儀器，選擇FAM和肥X通道，無巧光澤滅基團讀取結果； 陰性：雙檢測通道均無Ct/Cp值，且無特征性擴增曲線，表明樣品中無小反當獸疫病 毒； 雙陽性：雙檢測通道Ct/Cp值均《30. 0,且均出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中有小反 當獸疫病毒強毒； 單陽性：如僅FAM檢測通道出現(xiàn)特征性擴增曲線，且Cp/Ct值《30. 0,而肥X/VIC檢測 通道無Cp/Ct值并且無擴增曲線，表示樣本中僅存在小反當獸疫病毒疫苗毒。
[0013] 上述檢測方法，陰性對照用兩個檢測通道讀取數(shù)據(jù)時，應均無Ct/Cp值并且無擴 增曲線； 陽性對照用兩個檢測通道讀取數(shù)據(jù)時，應出現(xiàn)兩條相應的特征性擴增曲線，且Ct/Cp值均應小于等于28;如陰性或陽性對照不滿足W上條件，此次實驗視為無效。
[0014] 上述檢測方法，任一通道Ct/Cp值大于30. 0,且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品建議 復驗；復驗仍出現(xiàn)上述結果的，判為陽性，否則判為陰性。
[0015] 所述無小反當獸疫病毒，是指樣品中既沒有小反當獸疫病毒強毒，也沒有小反當 獸疫病毒疫苗毒。
[0016] 本發(fā)明選擇小反當獸疫病毒N基因編碼區(qū)特定序列作為祀?yún)^(qū)域，在多重序列比對 的基礎上，進行小反當獸疫病毒通用引物和探針設計；選擇小反當獸疫病毒Η基因編碼區(qū) 特定序列作為祀?yún)^(qū)域，在多重序列比對的基礎上，進行小反當獸疫病毒強毒引物和探針設 計選擇。引物長度為20個堿基左右，GC含量為50%-60%，引物內(nèi)無二級結構和重復性，弓I 物間和引物內(nèi)無互補序列，引物間的烙解溫度（Tm值）相差小于5°C。探針的長度在25個 堿基左右，Tm值比引物Tm值高5°C左右。
[0017] 小反當獸疫病毒通用探針序列的5'端標記報告巧光基團FAM(6-carboxy-巧光 素)，3'端標記澤滅基團TAMRA;小反當獸疫強毒探針序列的5'端標記報告巧光基團肥X (5-hexachloro-巧光素)，3'端標記澤滅巧光基團TAMRA。
[0018] 采用化qMan巧光PCR檢測技術建立了小反當獸疫病毒通用/強毒雙重定量巧光 RT-PCR檢測試劑盒，對反應的各種條件進行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃 度的優(yōu)化，引物探針濃度的優(yōu)化。
[0019] 本發(fā)明提供的試劑盒，由提取試劑盒和檢測試劑盒組成：提取試劑盒采用柱式 RNA提取方法，相對于化izol提取法，簡便、快速，而且提取效率高。
[0020] 所述提取試劑盒的組成，如下:_
BufferA為裂解液，主要由4M異硫氯酸脈、10%十二烷基肌氨酸鋼、4. 5%氯化鋼、30% 乙醇組成。
[00引]BufferB為洗液，主要由lOmMTris-肥I、lmM邸TA、70%乙醇組成。
[0022]BufferC溶解液，