主要由DEPC水組成。
[002引本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，可W-步 法確認(rèn)待檢樣品中是否存在小反當(dāng)獸疫病毒W(wǎng)及是否為強(qiáng)毒。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明選擇小反當(dāng)獸疫病毒的N基因和Η基因作為祀序列，分別 設(shè)計(jì)引物和探針建立并優(yōu)化了小反當(dāng)獸疫病毒通用/強(qiáng)毒雙重定量巧光RT-PCR檢測(cè)試劑 盒，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果： 1)快速：該方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，RT-PCR結(jié)束即可獲得結(jié)果，且較單重巧光RT-PCR檢測(cè)方法省時(shí)，具有快速、一步即可鑒別的優(yōu)勢(shì)。
[0025] 2)靈敏：由于采用了特異性的巧光探針和高靈敏度的巧光PCR儀，使該方法比傳 統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100~1000倍；對(duì)已知拷貝數(shù)的體外轉(zhuǎn)錄RNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯 示，試劑盒的靈敏度可達(dá)100拷貝/反應(yīng)。
[002引 3)特異：由于不僅采用了特異性的引物，而且采用了特異性的探針，使該方法的特 異性高于普通RT-PCR方法；用小反當(dāng)獸疫病毒通用/強(qiáng)毒雙重巧光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè) 牛病毒性腹瀉病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、牛白血病病毒、狂犬病病毒、A型流感病毒、口蹄 疫病毒等，均無交叉反應(yīng)，表明特異性良好。
[0027] 4)穩(wěn)定：重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好對(duì)不同濃度的已知拷貝 數(shù)的cRNA進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，變異系數(shù)小于5%。
[002引 5)不易污染：全封閉反應(yīng)，無需PCR后處理，操作安全。
【附圖說明】
[0029]圖1，W小反當(dāng)獸疫病毒強(qiáng)毒株感染組織為樣本的檢測(cè)結(jié)果；曲線A-D依次為樣 本進(jìn)行10 1、10 2、10 3、10 4稀釋后，肥X檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線；曲線a-d依次為樣本進(jìn)行10 1、 10 2、10 3、10 4稀釋后，F(xiàn)AM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線； 圖2,W小反當(dāng)獸疫病毒強(qiáng)毒株感染組織為樣本的檢測(cè)結(jié)果；曲線A-E依次為樣本進(jìn)行 10 1、10 2、10 3、10 4, 10 5稀釋后，肥X檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線；曲線曰-e 依次為樣本進(jìn)行10 1、10 2、10 3、10 4, 10 5稀釋后，fam檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線； 圖3,W牛病毒性腹瀉病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、牛白血病病毒、狂犬病病毒、A型流 感病毒、口蹄疫病毒為樣本，W小反當(dāng)獸疫病毒強(qiáng)毒株為陽性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果；曲線A為通 過肥X檢測(cè)通道讀取的陽性對(duì)照的擴(kuò)增曲線，曲線a為通過FAM檢測(cè)通道讀取的陽性對(duì)照 的擴(kuò)增曲線，底部直線為過FAM和肥X檢測(cè)通道讀取上述其他病毒(樣本）的檢測(cè)結(jié)果； 圖4,FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線，圖中的7條曲線，從左到右依次是稀釋到10 2, 10 3, 10 4， 10 5, 10 6, 10 7,10S濃度的擴(kuò)增曲線。
[0030] 圖5,肥X檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線，圖中的7條曲線，從左到右依次是稀釋到10 2, 10 3， 10 4, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8濃度的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 實(shí)施例1引物、探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank登錄的已發(fā)表的小反當(dāng)獸疫病毒N基因序列（Genbank登錄號(hào) 抓267273. 1)，小反當(dāng)獸疫強(qiáng)毒Η基因序列（Genbank登錄號(hào)AJ849636. 2)，設(shè)計(jì)小反當(dāng)獸 疫病毒通用引物、探針和小反當(dāng)獸疫強(qiáng)毒引物、探針序列。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小分別為 11化P、12化P。小反當(dāng)獸疫病毒通用探針序列的5'端標(biāo)記報(bào)告巧光基團(tuán)FAM( 6-carboxy-巧 光素)，3'端標(biāo)記澤滅基團(tuán)TAMRA;小反當(dāng)獸疫強(qiáng)毒探針序列的5'端標(biāo)記報(bào)告巧光基團(tuán)肥X (5-hexachloro-巧光素)，3'端標(biāo)記澤滅巧光基團(tuán)TAMRA。通過分析實(shí)驗(yàn)，得到W下引物： 通用-上游引物：5'GCCAACYGCTYCYGGARATCA3'，如沈QIDNO. 1 所示， 通用-下游引物：5'ATRGCYTGCAGCCTGAAGA3'，如沈QIDNO. 2 所示， 通用-探針：5'FAM-CCCTCGTGAGGCYCARAGRTCGGC-TMARA3，，如沈QIDNO. 3 所示； 強(qiáng)毒-上游引物：ATCCTGGATAGAGAACGCTTGGTC，如沈QIDNO. 4 所示， 強(qiáng)毒-下游引物：GCYCGGTGAAGCCTGATC，如沈QIDNO. 5所示， 強(qiáng)毒-探針：5' 肥X-CCAGCAGYCCGATTAGACTCAGRAACA-TAMRA3'，如沈QIDNO. 6 所示。
[0034] 實(shí)施例2柱式提取操作方法提取RNA 1、 取滅菌的1.5血離屯、管，加入BufferA500血、樣本各200血，充分混勻，室溫放 置10分鐘； 2、 取與離屯、管等量的RNase-Free吸附柱；將離屯、管中的溶液和絮狀沉淀轉(zhuǎn)移至 化ase-Free吸附柱，吸附柱套上收集管(為避免堵塞吸附柱，盡量不要吸懸浮雜質(zhì)）；13000 轉(zhuǎn)室溫離屯、30秒；棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中； 3、 吸附柱內(nèi)加入600uLBufferB，13000轉(zhuǎn)離屯、30秒；棄去收集管液體，將吸附柱放回 收集管中； 4、 重復(fù)步驟3 ; 13000轉(zhuǎn)空柱離屯、2分鐘，去除殘留液； 5、 將吸附柱移入新的1.5血離屯、管中，向柱中央加入50uLBufferC，室溫靜置1分鐘， 13000轉(zhuǎn)離屯、30秒，離屯、管中液體即為模板RNA。獲得的RNA溶液，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓?取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，若需長(zhǎng)期保存須放置-70 °C冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍 融）； BufferA為裂解液，主要由4M異硫氯酸脈、10%十二烷基肌氨酸鋼、4. 5%氯化鋼、30% 乙醇組成； BufferB為洗液，主要由lOmMTris-肥I、lmM邸TA、70%乙醇組成； BufferC溶解液，主要由DEPC水組成； 所述DEPC水：自來水兩次蒸饋，經(jīng)過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取 電阻率>18.0MQ.cm的水，得Millipore-Q純化水；然后向Millipore-Q純化水中加入 DEPC至終濃度為0. 1%，37°C攬拌處理12虹，15化f7in2 (1. 034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15 分鐘，即可。
[0035] 為避免RNA酶污染及保護(hù)操作者，進(jìn)行下述操作時(shí)，操作者必須帶口罩和一次性 手套。
[0036] 實(shí)施例3配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 15μL巧光RT-PCR反應(yīng)液和1. 0μL酶混合物加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻 后，取15μL作為檢測(cè)試劑；將檢測(cè)試劑裝入PCR管中，然后再加入lOul模板RNA，最終配 成25ul的反應(yīng)體系（1頭份)。
[0037] (1)巧光RT-PCR反應(yīng)液（1頭份）

;10XPCR緩沖液、25mmol/LMgC12 購(gòu)于Promega公司；5XRT-緩沖液，2. 5mmol/L dNTP購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司，引物和探針均委托大連寶生物生物工程有限公 司合成。其中10XPCR緩沖液的組成為：500mmol/LKC1、100mmol/LTris-肥1(抑9.0， 25°C)、1.0%TritonX-100。5XRT-緩沖液組成為 375mmol/LKCl、15mmol/LMgClz、 50mmol/LDTT、250mmol/LTris-肥 1 (p冊(cè).3,25°C)。所述DEPC水：自來水兩次蒸饋， 經(jīng)過Mi11iporeMIliJ-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率> 18.OMΩ.cm的水，得 11111口〇'6-9純化水；然后向11111口〇'6-9純化水中加入06口(：至終濃度為0.1%，37°(：攬拌 處理12虹，15化f7in2 (1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘，即可。
[003引 （2)酶混合物：由200U/μL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、5U/μL的TaqDNA聚合酶、40 U/μL的RNA酶抑制劑按2:1:1的體積比混合而成。
[0039] 實(shí)施例4巧光定量PCR 巧光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)如下設(shè)置： 第一階段：預(yù)變性，42°C/30min; 第二階段：92°C/3min; 第Ξ階段：94°C/15sec，54°C/25sec，60°C延伸35sec,共40個(gè)循環(huán)。巧光收集在 第Ξ階段每次循環(huán)的60°C延伸時(shí)進(jìn)行。
[0040] 結(jié)果讀取：對(duì)于多通道PCR儀，利用FAM(465-510)通道和肥X(VIC) (533-580) 讀取結(jié)果；對(duì)于ABI儀器，選擇FAM和肥X通道，無巧光澤滅基團(tuán)讀取結(jié)果； 雙陽性：雙檢測(cè)通道Ct/Cp值均《30. 0,且均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中有小反 當(dāng)獸疫病毒強(qiáng)