四己酸鹽、無機磯酸鹽和己醇胺。
[0029] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述顯色試劑包括底物溶液和顯色緩沖溶液；其 中，所述顯色緩沖溶液包括Cs~Cis烷基葡萄糖巧，優(yōu)選Cg~烷基葡萄糖巧。
[0030] 本發(fā)明的試劑盒通過在顯色試劑中添加烷基葡萄糖巧，在不影響酶催化底物反應 的前提下，使得顯色試劑具有了顯著的洗涂效果，從而可W省略傳統(tǒng)酶顯色之前的洗涂步 驟，極大縮短了傳統(tǒng)方法檢測祀核酸的耗時。
[0031] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，步驟B)中所述顯色溶液包含Tris-HCl緩沖溶液， 優(yōu)選PH9. 5的化is-HCl緩沖溶液。
[0032] 本發(fā)明的發(fā)明人經過大量實驗與創(chuàng)造性勞動發(fā)現，在本發(fā)明的試劑盒中，所述 Tris-HCl緩沖溶液能夠在顯色反應過程與烷基葡萄糖巧發(fā)生協(xié)同配合作用，實現對固相支 持物表面的清洗，去除非特異性吸附在固相支持物表面的物質，從而在雜交反應后無須經 過單獨的洗膜步驟就可W直接在顯色溶液中通過酶促反應使底物形成有色產物而顯色。
[0033] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述底物溶液包括但不限于；硝基藍四氮哇 (NBT)和5-漠-4-氯-3-剛巧基-磯酸度CI巧溶液、堅牢紅溶液和蔡酪ASMX溶液。在堿 性磯酸醋酶的催化下，BCIP會被水解產生強反應性的產物，該產物會和NBT發(fā)生反應，形成 不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-化rmazan。
[0034] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述固相支持物選自尼龍膜、硝酸纖維素膜或聚 丙帰膜；其中，尼龍膜和硝酸纖維素膜是優(yōu)選的，硝酸纖維素膜是特別優(yōu)選的。
[0035] 在本發(fā)明的方法中，選擇合適的固相支持物處理方法W及核酸探針在固相支持物 表面的固定方法在本領域技術人員的知識范圍內。
[0036] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述核酸探針選自長度為15~40個堿基的寡核 巧酸探針，優(yōu)選選自長度為16~25個堿基的寡核巧酸探針。
[0037] 本發(fā)明的試劑盒選擇了合適的核酸探針長度和組成，降低了核酸探針與生物素標 記祀核酸雜交的溫度，從而使得雜交反應與酶聯反應能夠統(tǒng)一成一個一步反應過程進行。 本發(fā)明的發(fā)明人經過大量實驗發(fā)現，所述核酸探針選自長度為15~40個堿基的寡核巧酸 探針時比較合適，優(yōu)選選自長度為16~25個堿基的寡核巧酸探針，此時雜交反應的溫度可 W為37~42°C。特別優(yōu)選的DNA探針的長度包括16、17、18、19、20、21、22、23、24和25個 堿基。
[0038] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述核酸探針包括：
[0039] 用于檢測結核分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;11~13 ;
[0040] 用于檢測鳥分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;14~16 ;
[0041] 用于檢測胞內分枝桿菌探針的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;17~19 ;
[0042] 用于檢測偶然分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;20~22 ;
[0043] 用于檢測賊腫分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;23~25
[0044] 用于檢測堪薩斯分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;26~28 ;
[0045] 用于檢測巧33C野生型的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;29~30 ;
[0046] 用于檢測巧33C突變的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;31~32 ;
[0047] 用于檢測巧31T野生型的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;33~34 ;
[0048] 用于檢測巧31T突變的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;35~36 ;
[0049] 用于檢測526野生型的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;37~38 ;
[0050] 用于檢測巧26G突變探針的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;39~40 ;
[0051] 用于檢測巧26T突變的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;41~42 ;
[005引用于檢測A526T突變探針的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;43~44 ;
[0053] 用于檢測A526G突變的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;45~46 ;
[0054] 用于檢測A516T野生型探針的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;47~48 ; [00巧]用于檢測A516T突變的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;49~50 ;
[0056] 用于檢測巧11C野生型探針的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;51~52 ;
[0057] 用于檢測巧11C突變的寡核巧酸探針，其序列選自SEQIDNOs;53~54。
[0058] 本發(fā)明的試劑盒W編碼16SrRNA基因序列作為細菌分類基礎，通過一次檢測實 驗就可鑒定致病性的、分離率最高的6種分枝桿菌作為試劑盒檢測指標；結核、鳥、胞內、偶 然、賊腫和堪薩斯分枝桿菌。此外，本發(fā)明的試劑盒還可W檢測rpoB基因531、526、516、 533、511和513氨基酸位點的8-10個基因突變型（臨床總覆蓋率超過90% )，W反映結核 菌對利福平的耐藥性。
[0059] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述核酸探針包括：
[0060] 用于檢測鳥分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;14所示；
[0061] 用于檢測胞內分枝桿菌探針的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;17所示；
[0062] 用于檢測偶然分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;20所示；
[0063] 用于檢測賊腫分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;23所示；
[0064] 用于檢測堪薩斯分枝桿菌的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;26所示；
[0065] 用于檢測巧33C野生型的寡核巧酸探針，其序列如SEQ ID NO ;29所示；
[0066] 用于檢測巧33C突變的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;31所示；
[0067] 用于檢測巧31T野生型的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;33所示；
[0068] 用于檢測巧31T突變的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;35所示；
[0069] 用于檢測526野生型的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;37所示；
[0070] 用于檢測巧26G突變探針的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;39所示；
[0071] 用于檢測巧26T突變的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;41所示；
[0072] 用于檢測A526T突變探針的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;43所示；
[0073] 用于檢測A526G突變的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;45所示；
[0074] 用于檢測A516T野生型探針的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;47所示；
[00巧]用于檢測A516T突變的寡核巧酸探針，其序列如SEQIDNO;49所示；
[0076] 用于檢測巧11C野生型探針的寡核巧酸探針，其序列如SEQ ID NO ;51所示；
[0077] 用于檢測巧11C突變的寡核巧酸探針，其序列如SEQ ID NO ;53所示。
[0078] 本發(fā)明的核酸探針具有靈敏度高和特異性高的優(yōu)點，用于檢測分支桿菌的探針是 根據分枝桿菌的leSrDNA基因序列設計的。16SrDNA是細菌系統(tǒng)分類學中最有用的和最常 用的分子鐘，存在于所有生物中，其進化具有良好的時鐘性質，在結構和功能上具有高度的 保守性，素有"細菌化石"之稱。16Sr大小適中，堿基長度約1. 5化左右，方便用于PCR擴增 和測序，成為系統(tǒng)發(fā)育關系分類的標準方法。16SrDNA結構由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，不同細 菌的恒定區(qū)序列基本保守，而可變區(qū)序列則因細菌而異，因此，可W根據其恒定區(qū)的序列設 計引物將16SrDNA擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對設計特異的探針對不同的細菌進 行分類。本發(fā)明設計的分枝桿菌探針能夠分別特異地鑒定結核分枝桿菌群（包括人型結核 分枝桿菌、牛結核分枝桿菌和非洲分枝桿菌，送Η種分枝桿菌基因序列及其致病性高度一 致，無需再分）、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、偶然分枝桿菌、賊腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿 菌而不與其它細菌菌種及其它分枝桿菌菌種交叉反應。用于檢測結核分枝桿菌rpoB基因 突變的探針；針對每種堿基突變型都設置了 2種探針，即該型的野生型（即未突變型）探針 和該突變型的突變探針。例如，當檢測的rpoB基因在531位點未發(fā)生突變時，531野生型探 針會呈陽性而對應的巧3 口突變探針則呈陰性；當檢測的rpoB基因在該位點發(fā)生531C-T 突變時，531野生型探針會呈陰性而巧3口突變型探針則呈陽性。從而能夠高度地識別不同 的單堿基突變的存在情況。同時，為了克服傳統(tǒng)探針檢測單堿基突變的信號不夠靈敏的缺 點，本發(fā)明進行了?？诘脑O計，在引入人工錯義突變的基礎上顯著增加了寡核巧酸探針的 長度，從而在保持送些探針的高度特異性型的基礎上大大提高了核酸探針的雜交信號。
[0079] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述核酸探針還包括陽性對照探針，其序列選自 SEQIDN0s;55~56。本發(fā)明的陽性對照探針可W來自人體Actin基因序列，其不僅能夠高 度特異地檢測樣本中的人體基因組的存在，而且能夠用于質控臨床樣本核酸的提取質量， 并質控檢測反應過程的正常進行。
[0080] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述核酸探針還包括陰性對照探針，其序列如SEQ IDNO;57所示。本發(fā)明的陰性對照探針可W來自引物設計軟件隨機生成的一段序列，其特 點是不與任何生物的核酸序列相似，其能夠起到很好的陰性對照作用，質控檢測反應的特 異性。
[00則根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述PCR反應試劑包括第一引物組，所述第一引 物組包括用于擴增leSrDNA的引物對和用于擴增rpoB基因的引物對；其中，
[008引用于擴增leSrDNA的上游引物序列如沈QIDNO;1所示；
[008引用于擴增leSrDNA的下游引物序列如SEQIDNO;2所示；
[0084] 用于擴增巧oB基因的上游引物序列如SEQIDNO;5所示；
[0085] 用于擴增巧oB基因的下游引物序列如SEQIDNO;6所示；
[0086] 每個引物對的上游引物的5'端均用生物素標記。
[0087] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述PCR反應試劑包括第二引物組，所述第二引 物組包括用于擴增leSrDNA的引物對和用于擴增rpoB基因的引物對；其中，
[008引用于擴增leSrDNA的上游引物序列如沈QIDNO;3所示；
[0089] 用于擴增leSrDNA的下游引物序列如SEQIDNO;4所示；
[0090] 用于擴增巧oB基因的上游引物序列如SEQIDNO;5所示；
[0091] 用于擴增巧oB基因的下游引物序列如SEQIDNO;6所示；
[0092] 每個引物對的上游引物的5'端用生物素標記。
[0093] 根據本發(fā)明的一個具體實施例，所述PCR反應試劑包括用于擴增作為陽性對照品 的Actin基因的引物對；其中，
[0094] 用于擴增Actin基因的上游引物序列如SEQIDNO;9所示，5'端生物素標記；
[0095] 用于擴增Actin基因的下游引物序列如SEQIDNO;10所示；
[0096] 本發(fā)明的試劑盒使用多重PCR引