C溫育60min;然后加入100μ1的lOmmol/LEDTA終止反應(yīng)（此時(shí)探針終濃 度為lpmol/μ1)。
[0165] 1.4核酸探針在固相支持物表面的固定：對(duì)加尾后核酸探針（lpmol/μ1))、陽(yáng)性 對(duì)照探針和陰性對(duì)照探針溶液，分別取1μ1 (含ipmol的探針量）點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，將 膜置于用TE浸濕的紙上，經(jīng)254皿紫外光照射lOmin固定。
[0166] 核酸探針在硝酸纖維素膜表面的排布順序如下表1所示：
[0167] 表 1 [016 引
[0169](二）PCR反應(yīng)試劑的制備
[0170] 2. 1引物溶液配制：分別用滅菌純水溶解用于擴(kuò)增leSrDNA的上游引物SEQID N0;1和下游引物SEQIDN0;2、用于擴(kuò)增巧oB基因的上游引物SEQIDN0;5和下游引物 SEQIDN0;6W及用于擴(kuò)增Actin基因的上游引物沈QIDN0;9和下游引物沈QIDNO: 10送6種引物的干粉，配制成濃度為100μΜ的引物溶液。
[017。 2. 2按照下列比例配制50μ1反應(yīng)體系的PCR反應(yīng)試劑：
[017引GoTaq酶；1U;
[0173] 酶反應(yīng)緩沖溶液；1X;
[0174] 用于擴(kuò)增leSrDNA的上游引物（SEQIDNO;1)，5'端生物素標(biāo)記；；0. 2μΜ;
[017引用于擴(kuò)增leSrDNA的下游引物（SEQIDNO;2) ;0. 2μΜ;
[0176] 用于擴(kuò)增巧οΒ基因的上游引物（SEQIDNO;5)，5'端生物素標(biāo)記；；0.2μΜ;
[0177] 用于擴(kuò)增巧οΒ基因的下游引物（SEQIDΝ0;6) ;0. 2μΜ;
[017引用于擴(kuò)增Actin基因的上游引物（SEQIDNO;9)，5'端生物素標(biāo)記；；0. 2μΜ;
[0179] 用于擴(kuò)增Actin基因的下游引物（SEQIDNO;10) ;0.2μΜ;
[0180] MgC!2 ;2.OmM;
[018。 dNTPsMix;每種核巧酸的濃度均為0. 2mM;
[0182] 余量為水；
[0183] 將上述各組分混勻，即可配成PCR反應(yīng)試劑。
[0184] (H)雜交液的制備
[0185] 表 2
[0186]
[0187] 分別量取150ml的20XSSC緩沖液和700ml的純水，充分混勻；然后向其中分別 加入 1. 36g的aiCl2、2. 03g的MgClz·6Η2〇、5πι1 的Tween20、lg的化L、20g的聚己二醇 8000W及Img的SA-AP和20g的BSA，充分溶解、混勻，補(bǔ)加純水至1000ml，即可得到組成如下的 雜交液；PH7. 0,3XSSC，1μg/mlSA-AP，lOmMaiClz，lOmMMgCl2,2%BSA，0. 5%Tween-20， 0. 1%P化，2%聚己二醇8000,余量為水。
[018引（四）顯色緩沖溶液的制備
[0189] 表 3
[0190]
[0191] 在 900ml純水中，加入 5. 8g化Cl、10. 2gMgClz·細(xì)20、12.IgTrisW及 0. 7g 正十二烷基葡萄糖巧充分溶解混勻，用濃肥1調(diào)節(jié)溶液抑值至9. 5 + 0. 1，轉(zhuǎn)移到容量瓶 中加純水定容至1000ml，得到組成如下的顯色緩沖液；PH9. 5、0.Imol/L化C1、0.Imol/L Tris-HCl、50mMMgClzW及0. 07%正十二烷基葡萄糖巧，余量為水。
[0192](五）底物制備
[019引 5.1底物l的制備；稱取100mg的NBT溶于lml的70%二甲基甲醜胺配成100mg/ ml的NBT水溶液，即底物1。
[0194] 5. 2底物2的制備：稱取50mg的BCIP溶于1ml的100%二甲基甲醜胺配成50mg/ ml的BCIP水溶液，即底物2。
[0195] 因此，本實(shí)施例的一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因突變的試劑盒的試劑盒的 具體組分如下表4所示，其包括PCR反應(yīng)試劑、固相支持物、含有堿性磯酸酶標(biāo)記鏈霉親和 素的雜交液W及顯色試劑；其中，所述PCR反應(yīng)試劑包括用于擴(kuò)增祀核酸的生物素標(biāo)記的 引物，所述固相支持物的表面固定有用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因突變的核酸探 針。
[0196] 表 4
[0197]
[0198] 實(shí)施例2;
[0199] 同實(shí)施例1，不同之處在于將實(shí)施例1中雜交液的組成調(diào)整為；3XSSC、0. 1μg/ml SA-AP、5mMaiCl2、5mMMgCl2、〇. 5%BSA、0. 03%Tween-20、0. 03% 化L和 2%聚己二醇8000， 余量為水。同時(shí)將顯色溶液的組分調(diào)整為；PH9. 5、0.Imol/L化is-HCl、0.Imol/L化Cl、 50mMMgCl2、0. 33mg/mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和0. 03%正十六烷基葡萄糖巧，余量為水。其 他條件不變。
[0200] 實(shí)施例3 :
[020。 同實(shí)施例1，不同之處在于將實(shí)施例1中雜交液組成調(diào)整為；3XSSC、1.5ug/ml SA-AP、50mMaiCl2、50mMMgCl2、7%BSA、l. 5%Tween-20、0. 3%CPAM和 4%聚己二醇 8000， 余量為水。同時(shí)將顯色溶液的組分調(diào)整為；PH9. 5、0.Imol/L化is-HCl、0.Imol/L化Cl、 50mMMgCl2、0. 33mg/mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和0. 2%正辛基葡萄糖巧，余量為水。其他條 件不變。
[0202] 實(shí)施例4 :
[020引同實(shí)施例1，不同之處在于將實(shí)施例1中雜交液組成調(diào)整為；3XSSC，0. 5μg/ml SA-AP，20mMaiCl2,20mMMgCl2，l%BSA，0. 05%TritonX-100,0. 05 %CPAM，4% 聚己二 醇8000,余量為水。同時(shí)將顯色溶液的組分調(diào)整為；PH9. 5、0.Imol/LTris-HCl、0.Imol/L NaCl、50mMMgCl2、0. 33mg/mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和 0. 05%正十二烷基葡萄糖巧，余量為 水。其他條件不變。
[0204] 實(shí)施例5 :
[020引同實(shí)施例1，不同之處在于將實(shí)施例1中雜交液組成調(diào)整為；3XSSC、1. 2μg/ml SA-AP、40mMaiCl2、40mMMgCl2、5%BSA、l%TritonX-100、0. 2%P化和4%聚己二醇8000， 余量為水。同時(shí)將顯色溶液的組分調(diào)整為；PH9. 5、0.Imol/L化is-HCl、0.Imol/L化Cl、 50mMMgCl2、0. 33mg/mlNBT、0. 17mg/mlBCIP和 0. 1%正十二烷基葡萄糖巧，余量為水。其 他條件不變。
[0206] 實(shí)施例6 :
[0207] 同實(shí)施例1，不同之處在于將實(shí)施例1中PCR反應(yīng)試劑中的引物替換為；用于擴(kuò)增 leSrDNA的上游引物序列如SEQIDN0;3所示；用于擴(kuò)增leSrDNA的下游引物序列如SEQID NO;4所不；用于擴(kuò)增巧oB基因的上游引物序列如SEQIDNO;5所不；用于擴(kuò)增巧oB基因 的下游引物序列如SEQIDN0;6所示；用于擴(kuò)增Actin基因的上游引物序列如SEQIDNO: 9;用于擴(kuò)增Actin基因的引物序列如SEQIDNO;10。每個(gè)引物對(duì)的上游引物的5'端用生 物素標(biāo)記。其他條件不變。
[020引 實(shí)施例7 :
[0209] 同實(shí)施例1，不同之處在于在實(shí)施例1中PCR反應(yīng)試劑還包括用于增強(qiáng)所述引物對(duì) 的PCR擴(kuò)增效率的加強(qiáng)引物對(duì)；其中，所述加強(qiáng)引物對(duì)的上游引物序列如SEQIDNO;7所 示，5'端生物素標(biāo)記；所述加強(qiáng)引物對(duì)的下游引物序列如SEQIDNO;8所示。其他條件不 變。
[0210] 實(shí)施例8:
[02·Μ] 同實(shí)施例6,不同之處在于在實(shí)施例1中PCR反應(yīng)試劑還包括用于增強(qiáng)所述引物對(duì) 的PCR擴(kuò)增效率的加強(qiáng)引物對(duì)；其中，所述加強(qiáng)引物對(duì)的上游引物序列如SEQIDNO;7所 示，5'端生物素標(biāo)記；所述加強(qiáng)引物對(duì)的下游引物序列如SEQIDNO;8所示。其他條件不 變。
[0212] W下為檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因突變的試劑盒的應(yīng)用實(shí)施例
[021引實(shí)施例9 ;用實(shí)施例1的試劑盒對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)
[0214] 本實(shí)施例中的臨床樣品來(lái)自一名對(duì)利福平耐藥的臨床結(jié)核病患者的姨樣本（經(jīng) 過(guò)提取核酸進(jìn)行PCR測(cè)序?qū)嶒?yàn)證實(shí)其rpoB基因在533位點(diǎn)發(fā)生了T一C的核酸堿基變異）。
[0215] (一）祀核酸的提取
[0216] 取1ml姨樣本與1ml濃度為4M的化0H溶液混勻，室溫放置30min液化姨，混勻 后，取1ml加到離必管內(nèi)W12000巧m轉(zhuǎn)速離必2min，棄上清，加入1ml生理鹽水懸浮，再W 1200化pm轉(zhuǎn)速離必2min，棄上清。余下步驟參照專利EP1407051B1的方法進(jìn)行；在離必管 內(nèi)加入200μITris-邸TA緩沖液（即TE緩沖液，P冊(cè).0)振蕩懸?。辉俜謩e加入兩種規(guī)格玻 璃珠（200μm直徑和900μm直徑，4 : 1質(zhì)量比例）；潤(rùn)旋振蕩5min，然后把經(jīng)振蕩處理過(guò) 的離必管置于90°C的水浴中加熱lOmin，W12000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離必，取上清備用。
[0217] (二）祀核酸的擴(kuò)增
[0引引 2. 1加模板：取49μ1PCR反應(yīng)試劑，加入1μ1步驟（一）中提取的核酸。
[0219] 2. 2PCR擴(kuò)增反應(yīng)；首先 95°C預(yù)變性 5min;然后 95°C1. 5min;55°C1. 5min;72°C, Imin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0220] 2. 3PCR產(chǎn)物的變性；將PCR產(chǎn)物在95°C賠育lOmin，然后冰浴5min。
[0221] (Η)-步反應(yīng)
[0222] 將表面固定有核酸探針的固相支持物放入1ml雜交液中，同時(shí)加入10μ1的步驟 (二）中變性后的PCR產(chǎn)物，混勻后于37°C反應(yīng)15min。
[0223] (四）顯色反應(yīng)
[0224] 4. 1配制顯色溶液：在顯色緩沖液中分別加入底物1和底物2各33μ1，配制成 10ml組分如下所示的顯色溶液；ΡΗ9. 5、0.Imol/LTris-肥 1、0.Imol/L化Cl、50mMMgClz、 0. 07%正十二烷基葡萄糖巧、0. 33mg/mlNBT和0. 17mg/mlBCIP，余量為水。
[0225] 4. 2顯色反應(yīng)：用綴子夾住步驟（Η)中反應(yīng)后的硝酸纖維素膜，讓固定有核酸探 針的硝酸纖維素膜表面向上，稍微傾斜膜，使得膜的一端高于另一端。用注射器取顯色溶液 從膜的上端的上方持續(xù)滴落顯色溶液，使得顯色溶液從上至下（從膜的上端滴入，從下端 流出滴落），連續(xù)流過(guò)硝酸纖維素膜的表面，流動(dòng)時(shí)間為lOmin，觀察顯色結(jié)果。
[0226] 本實(shí)施例的顯色結(jié)果如圖1所示。
[0227] 實(shí)施例10
[022引同實(shí)施例9,不同之處在于利用實(shí)施例2的試劑盒對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其他條件 保持不變。
[0229] 本實(shí)施例的顯色結(jié)果如圖2所示。
[0230] 實(shí)施例11
[0231] 同實(shí)施例9,不同之處在于利用實(shí)施例3的試劑盒對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其他條件 保持不變。
[0232] 本實(shí)施例的顯色結(jié)果如圖3所示。
[0233] 實(shí)施例12
[0234] 同實(shí)施例9,不同之處在于利用實(shí)施例4的試劑盒對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其他條件 保持不變。
[0235] 本實(shí)施例的顯色結(jié)果如圖4