識別mage-a1的高親和力結(jié)合分子的制作方法
【專利說明】識別MAGE-A1的高親和力結(jié)合分子 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及新的高親和力抗原識別構(gòu)建體，如抗體或T細(xì)胞受體，其特異性地 結(jié)合黑色素瘤相關(guān)抗原（MAGE)Al。本發(fā)明的構(gòu)建體特別用于診斷、預(yù)防或治療特征為 MGE-Al抗原的特異性表達(dá)的腫瘤疾病。還提供了編碼、包含或呈現(xiàn)本發(fā)明的抗原識別構(gòu)建 體的核酸、載體和宿主細(xì)胞，如CD4或CD8陽性T細(xì)胞。因此本發(fā)明提供用于免疫療法、特 別是過繼性T細(xì)胞療法的新手段，用于治療癌癥。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 盡管對診斷有癌癥的患者可用的診斷和治療選擇存在顯著的技術(shù)進(jìn)步，但預(yù)后仍 然通常不良，并且很多患者不能被治愈。免疫療法有希望對診斷有不同腫瘤的患者提供有 效、靶向的治療，具有不損害正常組織而根除惡性腫瘤細(xì)胞的潛力。理論上免疫體系的T細(xì) 胞能夠識別對腫瘤細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)模式，并且通過多種效應(yīng)機(jī)理介導(dǎo)它們的毀滅。過 繼式T細(xì)胞療法試圖利用并增強(qiáng)患者自身T細(xì)胞的根除腫瘤的能力，并且然后將這些效應(yīng) 物返回患者，在這樣的狀態(tài)下它們有效地清除殘留的腫瘤，但不損害健康組織。盡管這種方 法對腫瘤免疫領(lǐng)域來說不是新的，但過繼性T細(xì)胞療法的臨床使用中仍然很多的缺陷削弱 了該方法在癌癥治療中的充分使用。
[0004] TCR為免疫球蛋白超家族的異質(zhì)二聚體細(xì)胞表面蛋白，其與參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的 CD3復(fù)合物的無變異蛋白相關(guān)聯(lián)。TCR存在α β和γ δ的形式，其結(jié)構(gòu)上相似但是具有完 全不同的解剖學(xué)定位和可能的功能。天然異質(zhì)二聚體a PTCR的胞外部分由兩條多肽組 成，每條多肽均具有膜近側(cè)恒定區(qū)和膜遠(yuǎn)側(cè)可變區(qū)。每個(gè)恒定區(qū)和可變區(qū)均包括鏈內(nèi)二硫 鍵。可變區(qū)含有類似于抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的高度多態(tài)環(huán)。TCR基因療法的使用克服 了許多當(dāng)前的障礙。它允許使患者自身的T細(xì)胞具有預(yù)期特異性，并且在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生足 夠量的T細(xì)胞，避免它們耗竭。TCR將被轉(zhuǎn)導(dǎo)入中心記憶T細(xì)胞或具有干細(xì)胞特性的T細(xì) 胞，根據(jù)轉(zhuǎn)移其可確保更好的持續(xù)和功能。TCR被工程化的T細(xì)胞將被注入由于化療或放射 致使淋巴細(xì)胞減少的癌癥患者中，其允許有效的移植但抑制了免疫抑制。表達(dá)人MHC分子 和不同人TCR庫的轉(zhuǎn)基因小鼠被作為工具來快速地分析肽抗原是否為免疫原性，即，它們 是否被有效地加工并通過MHC分子呈現(xiàn)，它們是否有效地誘導(dǎo)免疫后的T細(xì)胞應(yīng)答（Li et al. 2010 Nat Med)。由Li et al所公布的使用ABabDII小鼠的過繼性T細(xì)胞療法的概念 在圖1中顯示。
[0005] 簡單地說，ABabDII小鼠中的⑶8+T細(xì)胞具有人T細(xì)胞受體（TCR)，所述受體識別 通過人MHC I型分子所呈現(xiàn)的抗原。與人相反，ABabDII小鼠對人腫瘤相關(guān)抗原（TAA)是 不耐受的。因此，當(dāng)接種人TAA時(shí)，ABabDII小鼠產(chǎn)生針對那些外來抗原有效的適應(yīng)性免疫 應(yīng)答，包括高親和力的抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增（圖1，右邊）。用合適的人TAA免疫后，可 以提取編碼ABabDII小鼠的高親和力TCR的遺傳信息（圖1，中間）。這些TCR可隨后通過 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)重表達(dá)于來自腫瘤患者的T細(xì)胞中。那些重新-靶向的T細(xì)胞可被轉(zhuǎn)回患 者中對抗腫瘤（圖1，左邊）。
[0006] 使用人TCR轉(zhuǎn)基因小鼠，因此不由小鼠基因組編碼的任何人肽序列適合用于免 疫，并且將產(chǎn)生具有最佳親和力的TCR。最佳親和力意味著T細(xì)胞僅限于人自身-MHC分子， 并且識別作為外來物的抗原肽，例如表現(xiàn)出不耐受庫。通過使用肽/MHC多聚體，可以分選 轉(zhuǎn)基因小鼠的特異性T細(xì)胞，例如通過單細(xì)胞PCR分離人TCR，優(yōu)化TCR用于有效表達(dá)而避 免與內(nèi)源性TCR錯(cuò)配，并用于通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)患者的T細(xì)胞（Uckert et al. 2008 Cancer iHiMinoI immunother ；kammertoens T et al. 2009 Eur J Tmmunol) 〇
[0007] 發(fā)現(xiàn)黑色素瘤抗原基因（MGE-A)在許多不同的組織學(xué)來源的腫瘤中表達(dá)。由 MGE基因所編碼的蛋白質(zhì)為腫瘤排斥抗原，其能誘導(dǎo)具有識別并且殺死癌細(xì)胞能力的特異 性細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞（CTL)。因此MGE基因和蛋白質(zhì)為用于發(fā)展新藥以通過免疫療法 對抗癌癥的優(yōu)選目標(biāo)。MGE-A蛋白質(zhì)構(gòu)成癌-睪丸抗原的亞家族，其主要在生殖細(xì)胞系中 表達(dá)，但不限于生殖細(xì)胞系。然而它們也在多種人癌癥中表達(dá)，在這里它們與惡性腫瘤相 關(guān)，并可能促進(jìn)惡性腫瘤。MGE抗原在腫瘤中而不在正常周圍健康組織中的這種特異性表 達(dá)使得該抗原家族用于定向的過繼式T細(xì)胞轉(zhuǎn)移十分引人注目。然而，由于缺乏靶向MGE 抗原的特異性高效抗體或T細(xì)胞受體，迄今為止已知沒有滿意的免疫療法。
[0008] 鑒于上述【背景技術(shù)】中的較大缺陷，本發(fā)明的目的是提供具有針對MGE-A抗原的 高親和力和特異性的新的抗原識別構(gòu)建體。而且，本發(fā)明意圖提供允許產(chǎn)生這種構(gòu)建體的 新方法。更廣泛的說，本發(fā)明設(shè)法提供用于免疫癌癥療法的新手段。
[0009] 第一方面，通過抗原識別構(gòu)建體解決上述問題，所述抗原識別構(gòu)建體包含與選自 SEQ ID No. 1-6 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或 100%序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID No 1-6對應(yīng)于本申請的圖4中所顯示的⑶R3區(qū)。 意外地發(fā)現(xiàn)，與針對MGE抗原的本領(lǐng)域現(xiàn)有的TCR相比，本發(fā)明的實(shí)施例中所提供的TCR 是高效的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原識別構(gòu)建體包含與選自SEQ ID No. 1-6 的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性 的互補(bǔ)決定區(qū)3(⑶R3)。
[0010] 本發(fā)明的上下文中所優(yōu)選的抗原識別構(gòu)建體進(jìn)一步包含選自TRAV5、TRAV13-1、 TRAVl2-3、TRBV28、TRBV29-1、TRBVl3、TRBV20、TRBVl2 的 V 元件和 / 或選自 TRAJ41、TRAJ29、 TRAJ31、TRAJ49、TRAJ34、TRBJ2-7、TRBJ2-2、TRBJ2-6、TRBJ7、TRBJ1-2 的 V 元件；優(yōu)選如表 1中所描述地組合。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的抗原識別構(gòu)建體對黑色素瘤相關(guān)抗原MGE家族的抗原是特異的和 /或特異性地結(jié)合黑色素瘤相關(guān)抗原MGE家族的抗原。已知多種蛋白質(zhì)屬于MGE家族的 一部分，所述MAGE家族也包括一些假基因。由全部MGE家族成員所共享的一個(gè)同源區(qū)為 一段約200個(gè)氨基酸的區(qū)域，其已被命名為MGE保守結(jié)構(gòu)域。MGE保守結(jié)構(gòu)域通常位于臨 近C端，盡管它也可以發(fā)現(xiàn)于一些蛋白質(zhì)的更中心的位置。MGE保守結(jié)構(gòu)域通常呈現(xiàn)為單 拷貝，但在一些蛋白質(zhì)中是重復(fù)的。通過本發(fā)明的抗原識別構(gòu)建體可檢測的MGE基因選自 MAGE-BI、MAGE-AI、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-A2B、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、 MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B18、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、 MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-B6B、MAGE-Cl、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-Dl、MAGE-D2、MAGE-D4、 MAGE-El、MAGE-E2、MAGE-Fl、MAGE-HI、MAGE-L2、NDN、NDNL2。本發(fā)明的上下文所優(yōu)選的為選 自以下的 12 個(gè)同源的 MAGE 蛋白：MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、 MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO、MAGE-All 或 MAGE-Al2。最優(yōu)選的為對 MAGE-Al 具 有特異性的抗原識別構(gòu)建體。
[0012] 本文所使用的術(shù)語"特異性"或"抗原特異性"或?qū)χ付乖?特異"指抗原識別構(gòu) 建體能特異性地結(jié)合并且免疫地識別所述抗原，優(yōu)選MGE-Al，更優(yōu)選具有高親和力。例如， 如果表達(dá)TCR的T細(xì)胞與用低濃度（例如，約10 nmol/l、10 1VoizIUO 9mol/l、10smol/l、 10 7mol/l、10 6mol/l、10 5mol/l)的 MAGE 肽（如 MAGE-A1HLA-A02 限制性 MAGE-Al278 286肽） 脈沖的祀細(xì)胞共培養(yǎng)分泌至少約200pg/ml或更多（例如，250pg/ml或更多、300pg/ml或更 多、400pg/ml 或更多、500pg/ml 或更多、600pg/ml 或更多、700pg/ml 或更多、1000pg/ml 或更 多、2,000pg/ml或更多、2,500pg/ml或更多、5,000pg/ml或更多）的干擾素 γ (IFN-γ)，那 么該TCR可被認(rèn)為對MGE-Al具有"抗原特異性"?？蛇x地或另外，如果表達(dá)TCR的T細(xì)胞 與用低濃度的HLA-A02限制性MGE-Al脈沖的靶細(xì)胞共培養(yǎng)分泌比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的IFN-γ的背 景水平至少兩倍多的IFN- γ，那么該TCR可被認(rèn)為對MGE-Al具有"抗原特異性"。如上所 述的這樣的"特異性"-例如-可用ELISA分析。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案公開了抗原識別構(gòu)建體，其為抗體的形式，或其衍生物或 片段，或者T細(xì)胞受體（TCR)的形式，或其衍生物或片段。本文所公開的抗體或TCR的片段 或衍生物優(yōu)選地仍然分別具有如原始抗體或TCR的抗原特異性（對于抗原的結(jié)合功能）。
[0014] 天然α-β異質(zhì)二聚體TCR具有α鏈和β鏈。每條鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒 定區(qū)，并且β鏈通常還含有在可變區(qū)和連接區(qū)之間的短的多變區(qū)，但是該多變區(qū)經(jīng)常被認(rèn) 為是連接區(qū)的一部分。每個(gè)可變區(qū)包含在骨架序列中所嵌入的三個(gè)C