取50 μ L上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里，同時(shí)作好標(biāo)記。
[0058] (5)混勻GENMED反應(yīng)液，每孔分別加入50 μ L GENMED反應(yīng)液，再分別每孔加入 10 μ L GENMED顯色液，搖動(dòng)96孔板混勻。
[0059] (6)在室溫下孵育30min，避免光照。
[0060] (7)每孔分別加入10 μ L GENMED終止液。
[0061] (8)即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測(cè)定光吸收度（A)，選擇波長(zhǎng)570nm。
[0062] (9)根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞死亡率：
[0063] 處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)=處理樣品孔吸光讀數(shù)一樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù)一背景空 對(duì)照孔吸光讀數(shù)
[0064] 樣品細(xì)胞最大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)=樣品最大酶活性對(duì)照孔吸光讀數(shù)一樣品 對(duì)照孔吸光讀數(shù)一背景空對(duì)照孔吸光讀數(shù)
[0065] 細(xì)胞死亡率=(處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)+樣品細(xì)胞最大酶活性的實(shí)際吸光讀 數(shù)）X100%
[0066] 3. 3肝細(xì)胞功能指標(biāo)的測(cè)定
[0067] 按上述方法進(jìn)行細(xì)胞分組、預(yù)處理和模擬缺血再灌注損傷。到終末時(shí)間點(diǎn)分別 將各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 μ L收集于Ep管中，每管分別加入100 μ L完全培養(yǎng)基稀釋至 200 μ L，室溫下離心5min，速度為1200r/min。取上清液在全自動(dòng)生化儀下檢測(cè)ASUALT和 LDH水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。
[0068] 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0069] 使用SPSS 13. 0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X 土s) 表示，組間比較采用單因素方差分析，P < 0. 05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0070] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0071] 1、化合物（I )預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞活力的影響
[0072] IR組肝細(xì)胞活力比N組明顯下降（P〈0. 05)，表明體外模擬缺血再灌注過(guò)程成功地 造成了肝細(xì)胞的缺血再灌注損傷。給予5ng/mL化合物（I )預(yù)處理1小時(shí)，缺血再灌注損 傷肝細(xì)胞的活力較缺血再灌注組和生理鹽水組增強(qiáng)（P〈〇. 05)，但未能恢復(fù)到正常組肝細(xì)胞 活力水平（P〈〇. 05)，生理鹽水組則與缺血再灌注組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05)。而0. 5ng/ mL和50ng/mL濃度的化合物（I )預(yù)處理1小時(shí)，均未能增強(qiáng)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞的活 力（P>0. 05)，其肝細(xì)胞活力與生理鹽水組之間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05)。結(jié)果見(jiàn)表1 (A表示與N組比較，P〈0. 05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義蘆表示與IR組和NS組比較，P〈0. 05,差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下同）。
[0073] 2、化合物（I )預(yù)處理對(duì)肝細(xì)胞缺血再灌注損傷的細(xì)胞繁殖和毒性的影響
[0074] 與正常組相比，體外模擬缺血再灌注損傷使細(xì)胞死亡率>90 %。給予5ng/mL化合 物（I )預(yù)處理1小時(shí)，肝細(xì)胞死亡率下降約35%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0. 05)，但其細(xì)胞 死亡率仍比正常組高約50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0. 05);而生理鹽水組肝細(xì)胞死亡率比 缺血再灌注組雖略有下降（約為8%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.5ng/mL和50ng/mL濃度的 化合物（I )預(yù)處理1小時(shí)，肝細(xì)胞死亡率比缺血再灌注組分別降低6%和13%，但差異無(wú) 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>〇. 05);而與生理鹽水組的肝細(xì)胞死亡率相近（P>0. 05)。結(jié)果見(jiàn)表2。
[0075] 3、化合物（I )預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞肝功能指標(biāo)的影響
[0076] 與正常組比較，缺血再灌注損傷組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ALT水平未見(jiàn)明顯升高 (P>0. 05);而AST、LDH水平以及AST/ALT比值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0. 05)。給予 5ng/mL化合物（I )預(yù)處理1小時(shí)，肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的AST、LDH水平以及AST/ALT比值 較缺血再灌注組和生理鹽水組降低，但仍較正常組高（P〈〇. 05);而ALT水平與缺血再灌注 組和生理鹽水組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05)。生理鹽水組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ALT、 AST、LDH水平以及AST/ALT比值與缺血再灌注組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05)。0. 5ng/ mL和50ng/mL化合物（I )預(yù)處理1小時(shí)，均未能使肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的AST、LDH水平 降低（P>0. 05)。結(jié)果見(jiàn)表3。
[0077] 本研究顯示，化合物（I ) (RE2組）使肝細(xì)胞對(duì)之后經(jīng)歷的缺血再灌注損傷的耐 受力增強(qiáng)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率降低。以上結(jié)果提示，化合物（I )預(yù)處理 能夠減輕人肝細(xì)胞缺血再灌注損傷，起到肝細(xì)胞保護(hù)作用。
[0078] 表1MTT法檢測(cè)化合物（I )預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞活力的影響
[0081] 表2LDH釋放法肝細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測(cè)細(xì)胞死亡率
[0083] 表3肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH水平的變化（η = 5)
[0085] 實(shí)施例3
[0086] 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:7的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0087] 實(shí)施例4
[0088] 口服液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制 成口服液。
[0089] 實(shí)施例5
[0090] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0091] 實(shí)施例6
[0092] 注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0093] 實(shí)施例7
[0094] 無(wú)菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無(wú)菌注射 用水中，攪拌使溶，用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌 熔封得粉針劑。
[0095] 上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I):2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a) 將兩面針的干燥根粉碎，用80~90 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用 石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁 醇萃取物；(b)步驟（a)中正丁醇取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再 用75 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75 %洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫濃縮物；（c)步 驟（b)中75%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為65:1、30:1、15:1和8:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依 次用體積比為15:1、8:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中 組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗 脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：步驟（a)中，用85% 乙醇熱回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹(shù)脂為AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物 (I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備肝臟保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備肝臟保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種肝臟保護(hù)作用的檸檬苦素類(lèi)化合物及其制備方法，屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的檸檬苦素化合物，可以從兩面針的干燥根中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物預(yù)處理能夠減輕人肝細(xì)胞缺血再灌注損傷，起到肝細(xì)胞保護(hù)作用，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)成肝臟保護(hù)的藥物。
【IPC分類(lèi)】A61K31/366, A61P1/16, C07D493/08
【公開(kāi)號(hào)】CN105384749
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510674119
【發(fā)明人】高忠青
【申請(qǐng)人】淄博夸克醫(yī)藥技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日