一種復(fù)合微生物菌劑及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及復(fù)合微生物菌劑，具體地說(shuō)，涉及一種用于處理中草藥廢液的復(fù)合微 生物菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 中草藥是中華民族傳統(tǒng)的瑰寶，因其獨(dú)特的功效，其在世界醫(yī)學(xué)中有著重要的地 位。隨著時(shí)代的發(fā)展，我國(guó)的中草藥制藥發(fā)展迅速，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前市場(chǎng)上的中草藥廠家大約 有2000多家。中草藥在制藥在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢液，廢液大部分是直接排出，或 進(jìn)入污水處理系統(tǒng)。中草藥廢液中含有大量的有機(jī)物，以及糖類(lèi)、木質(zhì)素、生物堿等污染物， 直接排出會(huì)污染地下水，而且產(chǎn)生的臭氣會(huì)嚴(yán)重影響人們的生活和健康。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥 廢液中豐富的有機(jī)物、氮源以及微量元素進(jìn)行合理處理可以在利用，對(duì)可持續(xù)發(fā)展具有重 要影響。
[0003] 當(dāng)前，處理中草藥廢水的方法依然沿用的是制藥廢水的處理方法，包括物化法和 生物法。其中物化法主要是混凝法、吸附法、電解法及氣浮法等。主要是他通過(guò)物理吸附、 化學(xué)沉底及化學(xué)氧化法，將廢液中的有害物進(jìn)行吸附、氧化，從而達(dá)到去除污染的目的。有 研究表明，中藥廢水經(jīng)過(guò)氣浮法處理后，COD的去除率可以達(dá)到50%，固體懸浮物的去除率 達(dá)到80%以上，但同時(shí)處理后的廢液中仍然有大量的有機(jī)物，需要進(jìn)一步的處理。目前，我 國(guó)利用物化法處理中草藥廢液的具體案例較少，主要是成本太高，勞動(dòng)強(qiáng)度大，產(chǎn)生二次污 染，具有一定的局限性。生物法主要是采用厭氧及好氧的方法，能夠有效的去除廢液中的大 部分污染物，其中好氧生物法包括活性污泥、曝氣氧化池處理等方法，厭氧處理法包括厭氧 固定生物反應(yīng)器、厭氧穩(wěn)定塘等方法。這些方法的處理特點(diǎn)是將中草藥廢液?jiǎn)渭兊淖鳛槲?水處理，而其中的有機(jī)物、氮源及微量元素等物質(zhì)沒(méi)有得到進(jìn)一步的應(yīng)用，從能源循環(huán)利用 的方面來(lái)說(shuō)，這種方法是不可取的。如何在處理中草藥廢液的同時(shí)充分利用中草藥廢液中 有機(jī)物、氮源等物質(zhì)是一項(xiàng)重要的研究?jī)?nèi)容。近些年有些企業(yè)嘗試?yán)梦⑸飳⒅胁菟庍M(jìn) 行發(fā)酵，通過(guò)微生物的分解作用，將廢液中的有機(jī)物、氮源等物質(zhì)進(jìn)行分解、轉(zhuǎn)化，得到的產(chǎn) 品在添加一些營(yíng)養(yǎng)成分，將其制作成生物肥料，是一個(gè)有益的嘗試。然而，由于中草藥廢液 中有機(jī)物、COD及有害物質(zhì)含量較高，對(duì)微生物的耐受性有很高的要求，到目前為止還未有 專(zhuān)門(mén)的微生物菌劑針對(duì)處理中草藥廢液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種用于處理中草藥廢液 的復(fù)合微生物菌劑及其制備方法與應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供一種復(fù)合微生物菌劑，所述復(fù)合微生物菌劑包括：枯草芽孢 桿菌、巨大芽孢桿菌、畢赤酵母和毛霉。
[0007] 本發(fā)明在進(jìn)行了大量客觀實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，綜合利用了枯草芽孢桿菌的快速分 解木質(zhì)素，纖維素等有機(jī)物的特性，巨大芽孢桿菌的抗病原菌特性、畢赤酵母的分解有機(jī)物 的特性和毛霉的產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶分解小分子肽和氨基酸的特性，針對(duì)中草藥廢液中的 有機(jī)物等物質(zhì)更好的進(jìn)行處理或分解，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。
[0008] 進(jìn)一步地，所述復(fù)合微生物菌劑的總活菌數(shù)不低于3X 10scfU/mL。滿足該條件的 復(fù)合微生物菌劑能夠更好的對(duì)中草藥廢液中的有機(jī)物等物質(zhì)進(jìn)行分解。
[0009] 更進(jìn)一步，所述復(fù)合微生物菌劑中：枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為lX10s-6X10 scfU/ mL，巨大芽孢桿菌的活菌數(shù)為I. 5X 107-5X 107cfu/mL，畢赤酵母的活菌數(shù)為 2X 10S-4X 10scfu/mL，毛霉的活菌數(shù)為I X 106-4X 106cfu/mL。當(dāng)所述復(fù)合微生物菌劑滿足 上述條件時(shí)，各微生物能夠充分發(fā)揮各自的功效，迅速分解廢液中的相關(guān)成分，如：枯草芽 孢桿菌能夠產(chǎn)生大量纖維素酶和半纖維素酶，分解廢液中木質(zhì)素、纖維素等物質(zhì)，巨大芽孢 桿菌能夠產(chǎn)生大量的脂肽、多肽等抗菌物質(zhì)，有效抑制廢液中的大腸桿菌等病原菌、毛霉能 夠產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶，可以分解廢液中的小分子肽和氨基酸等。所述枯草芽孢桿菌、巨大 芽孢桿菌、畢赤酵母和毛霉市售可得。
[0010] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供了在分解中草藥廢液中污染物效果上更優(yōu)的菌種，如： 所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌VTS - 2 (Bacillus subtilis)，所述巨大芽孢桿菌為 VTS - I (Bacillus megatherium)，所述畢赤酵母為畢赤酵母 VTJ - 6 (Pichia pastoris)，所 述毛霉為犁頭霉VTJ - 3 (Absidia)。
[0011] 第二方面，本發(fā)明提供了前述復(fù)合微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：
[0012] 1)固體斜面培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌分別接種于牛肉膏蛋白胨固體 培養(yǎng)基中，畢赤酵母、毛霉分別接種于PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使菌株充分活化；
[0013] 其中，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水 lOOOmL，瓊脂20g。PDA固體培養(yǎng)基配方為土豆200g，葡萄糖20g，水lOOOmL，瓊脂20g。
[0014] 2) -級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟1)中活化的枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌分別接種于牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，活化的畢赤酵母、毛霉分別接種于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)液體培養(yǎng)菌 密度OD 6。。值達(dá)到0. 6-0. 8時(shí)停止培養(yǎng)，分別獲得一級(jí)種子液；
[0015] 其中，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，H2O 1000 mL; PDA培養(yǎng)基配方為土豆200g，葡萄糖20g，H201000mL。
[0016] 3)二級(jí)種子培養(yǎng)：將所得枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的一級(jí)種子液分別接種于 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所得畢赤酵母、毛霉的一級(jí)種子液分別接種于PDA培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，分別獲得二級(jí)種子液；
[0017] 其中，所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基同步驟2)。
[0018] 4)將步驟3)中獲得的4種微生物的二級(jí)種子液分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行高 密度發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌劑A、B、C、D ;
[0019] 其中，菌劑A為由枯草芽孢桿菌制備的菌劑，菌劑B為由巨大芽孢桿菌制備的菌 劑、菌劑C為由畢赤酵母制備的菌劑，菌劑D為由毛霉制備的菌劑。
[0020] 5)將菌劑A、B、C、D混合，即得復(fù)合微生物菌劑。
[0021] 作為優(yōu)選，所述菌劑A、B、C、D以1-3:1-3:1-3:2-3的體積比混合。所述菌劑A、B、 C、D在該體積比例下混合，能夠使復(fù)合微生物菌劑具有更好的菌種數(shù)量組成從而達(dá)到最佳 的處理中草藥廢液的效果。
[0022] 作為優(yōu)選，步驟4)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方按質(zhì)量百分比為：糖蜜4-6%、玉米 粉 0· 35-0. 45%、硫酸銨 0· 5-0. 7%，磷酸二氫鉀 0· 05-0. 15%，硫酸鎂 0· 05-0. 15%，余量為 水，pH為7. 0-7. 2。該培養(yǎng)基特別適宜前述微生物種子液的發(fā)酵。
[0023] 進(jìn)一步地，所述步驟1)的培養(yǎng)條件為在28_30°C下培養(yǎng)1-3天；所述步驟2)和3) 的培養(yǎng)條件為在28-30°C，160-180rpm下培養(yǎng)1-3天；所述步驟4)具體為：
[0024] 枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液以5-15 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28_30°C， 110_150rpm，通氣量1.0 -L 5vvm下進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)l_2d ;
[0025] 巨大芽孢桿菌二級(jí)種子液以5-15 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28-30°C， 160_200rpm，通氣量1.0 -L 5vvm下進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)l_2d ;
[0026] 畢赤酵母二級(jí)種子液以10-20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28-30 °C， 110_150rpm，通氣量0· 8-1. Ovvm下進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)l_2d ;
[0027] 毛霉二級(jí)種子液以10-20 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28-30 °C， 110_150rpm，通氣量0· 8-1. Ovvm下進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)l-2d。
[0028] 按照上述接種量接種以上種子液進(jìn)行發(fā)酵，能夠保證各菌種發(fā)酵后的數(shù)量以及菌 株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的量。
[0029] 第三方面，本發(fā)明提供了前述復(fù)合微生物菌劑在處理中草藥廢液中的應(yīng)用。
[0030] 作為優(yōu)選，將所述復(fù)合微生物菌劑以0. 05% v/v的比例加入到中草藥廢液中，于 28°C，160rpm，通氣量L O-L 5vvm下進(jìn)行好氧發(fā)酵5d。當(dāng)所述復(fù)合微生物菌劑按照上述條 件對(duì)中草藥廢液進(jìn)行處理，能夠使菌劑更好的發(fā)揮分解效果，提高菌劑分解中草藥廢液中 有機(jī)物的速率。
[0031] 第四方面，本發(fā)明提供了一種復(fù)合微生物水溶性肥，其原料來(lái)自經(jīng)前述復(fù)合微生 物菌劑處理后的中草藥廢液。當(dāng)中草藥廢液經(jīng)前述復(fù)合微生物菌劑后，含有豐富的微生物 種群及各