一種生物素化無機焦磷酸酶的表達方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種生物素化無機焦磷酸酶的表達方法。
【背景技術】
[0002] 無機焦磷酸酶（Inorganic Pyrophosphatase, PPase, EC3. 6. I. 1)是一類能夠催化 焦磷酸水解為正磷酸的酶。焦磷酸（Pyrophosphoric acid，PPi)是生物體內(nèi)DNA和RNA聚 合、氨基酸活化、氨酰tRNA合成、脂肪酸的β -氧化、脂酰輔酶A合成、纖維素合成、葡萄糖 合成以及淀粉合成等過程的副產(chǎn)物，PPase通過分解PPi可使上述反應向合成方向進行并 為多種生物合成反應提供能量。PPase廣泛存在于自然界，在動物、植物和微生物中均有發(fā) 現(xiàn)，并隨著技術手段的發(fā)展，現(xiàn)已成功地從日本吸血蟲、水稻、大麥、煙草、酵母、枯草芽胞桿 菌、大腸桿菌以及嗜熱細菌中獲得了 PPase的cDNA克隆。生物體內(nèi)存在無機焦磷酸酶共分 為四類：膜結合的無機焦磷酸酶（H+-PPase)和可溶性的家族Ι、ΙΙ、ΙΙΙ三類無機焦磷酸酶。 根據(jù)其細胞定位與亞基結構，PPase在催化反應中，需要結合三或四個2價金屬陽離子，例 如二價鎂離子（Mg 2+)。PPase在體外具有增強DNA聚合酶的擴增效率以及增強RNA聚合酶 在體外轉錄反應中的產(chǎn)量的功能。除此之外，PP ase在焦磷酸測序等DNA測序技術中發(fā)揮 重要作用。
[0003] 焦磷酸測序技術（Pyrosequencing)是利用生物發(fā)光反應進行序列測定的新一代 測序技術。其基本原理為：在每一輪測序反應中，只加入四種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP)中 的一種，若該dNTP能夠與DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的催化下，將其 摻入到測序引物鏈的3'末端，同時釋放出一分子的PPi ;在ATP硫酸化酶的作用下，生成的 PPi可以和5' -磷酰硫酸（Adenosine-5' -phosphosulfat，APS)結合形成等量的腺噪呤核 苷三磷酸（ATP);生成的ATP在熒光素酶的催化下，可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同 時產(chǎn)生可見光，通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則 和相匹配的堿基數(shù)成正比；如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個堿基配對，則上述反 應不會發(fā)生，也就沒有檢測峰；反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在三磷酸腺苷雙 磷酸酶（Apyrase)的作用下發(fā)生降解；待上一輪反應完成后，加入另一種dNTP，使上述反應 重復進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。近年來出現(xiàn)了一種高通量光 導纖維微反應池陣列焦磷酸測序技術，該技術一次可以測定上百萬個樣品，其出現(xiàn)帶來了 測序技術的革命，極大地推動了后基因組計劃的發(fā)展。在上述高通量焦磷酸測序技術中，除 了 DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶以外，PPase是另一個重要 用酶，其作用是通過清除多余的PPi來減少每一輪堿基加入期間反應倉微孔之間的交叉干 擾，并且能夠降低測序反應中的背景噪音。
[0004] 用于高通量焦磷酸測序技術的PPase需要被固定在微球表面，實現(xiàn)固定化的常用 手段是將酶蛋白經(jīng)過生物素標記后，通過與微球表面的鏈親和素反應，從而被固定在微球 表面。這就需要對PPase進行生物素化修飾。目前，通過化學手段能夠實現(xiàn)蛋白質的生物 素化修飾，其原理是通過化學反應將生物素連接到蛋白質中賴氨酸殘基的游離氨基上。酶 作為一種生物活性蛋白質，對有機試劑等因素非常敏感，然而在化學修飾過程中常常需要 引入大量有機試劑，存在使酶活性降低甚至喪失的可能性；在化學修飾的過程中，如果處于 蛋白質活性中心的賴氨酸殘基被修飾，也很可能影響到酶蛋白質的催化活性；此外，化學修 飾法還存在操作繁瑣和產(chǎn)物不均一的缺點。
[0005] 因此，提供一種PPase的生物素化修飾方法，使其能夠直接在細胞內(nèi)被生物素修 飾，能有效避免化學修飾法的缺陷或不良影響，同時增強其在焦磷酸測序技術中的實際應 用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬技術領域的 普通技術人員通常理解的相同意義。
[0007] 本發(fā)明中的術語"BAP23"指序列為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的生物素受體 蛋白。
[0008] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種生物素化無機焦磷酸酶的表達方法，以實現(xiàn)無 機焦磷酸酶在宿主細胞內(nèi)的生物素化修飾，為了解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案如 下：
[0009] -種生物素化無機焦磷酸酶的表達方法，其中：使用一種由23個氨基酸殘基組成 的生物素受體蛋白BAP23,將該生物素受體蛋白的編碼基因構建到大腸桿菌表達載體中，獲 得一種攜帶上述生物素受體蛋白編碼基因的重組表達載體，當無機焦磷酸酶的編碼基因構 建到上述重組表達載體中后，能夠表達該生物素受體蛋白和無機焦磷酸酶的融合蛋白，該 融合蛋白能夠在大腸桿菌細胞內(nèi)被生物素化修飾。
[0010] 其中，所述的生物素受體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示：
[0011] MAQRLFHILDAQKIEffHGPKGGS
[0012] -種生物素化無機焦磷酸酶的表達方法，包括以下步驟：
[0013] ⑴.合成生物素受體蛋白BAP23的編碼基因；
[0014] ⑵.將步驟⑴合成的生物素受體蛋白BAP23的編碼基因構建到大腸桿菌表達載體 中，獲得重組表達載體A ;
[0015] ⑶.將無機焦磷酸酶的編碼基因構建到步驟⑵所得的重組表達載體A中，獲得重 組表達載體B ;
[0016] ⑷.用步驟⑶所得的重組表達載體B轉化大腸桿菌宿主細胞，獲得重組基因工程 菌A;
[0017] (5).以步驟⑷所得的重組基因工程菌A作為生產(chǎn)菌株，進行誘導表達培養(yǎng)。
[0018] 本發(fā)明所述的表達方法步驟⑴中所述的BAP23編碼基因的核苷酸序列可以為SEQ ID NO :2所示的序列。但根據(jù)本領域公共知識，密碼子具有簡并性，編碼同一種氨基酸可以 有幾種不同的密碼子，因此本發(fā)明所述的BAP23的編碼基因序列并不局限于SEQ ID NO :2 所示的核苷酸序列。
[0019] 本發(fā)明所述的表達方法步驟⑵中的大腸桿菌表達載體為pMAL-p4E、pMAL-p4X、 pMAL-p5E、pMAL-p5X、pET22b (+)、pET28a (+)、pET30a (+)和 pET32a (+)中的任意一種；優(yōu)選 為pMAL-p4E、pMAL-p5E、pET28a(+)和pET30a(+)中的任意一種；進一步優(yōu)選為pMAL-p4E和 pET30a(+)中的任意一種；最優(yōu)選為pET30a(+)。
[0020] 本發(fā)明所述的表達方法步驟⑶中所述的無機焦磷酸酶的編碼基因可以通過PCR 擴增或化學全合成的方式獲得。
[0021] 本發(fā)明所述的表達方法步驟⑶中所述的無機焦磷酸酶的編碼基因應當與BAP23 的編碼基因位于同一多克隆位點區(qū)。
[0022] 本發(fā)明所述的表達方法步驟⑶中所述的無機焦磷酸酶的編碼基因可以構建到 BAP23的編碼基因的上游或下游；優(yōu)選為上游。
[0023] 當本發(fā)明所述的表達方法步驟⑶中所述的無機焦磷酸酶的編碼基因位于BAP23 的編碼基因上游時，應當去掉無機焦磷酸酶的編碼基因的終止密碼子。
[0024] 本發(fā)明所述的表達方法步驟⑷中所述的大腸桿菌宿主細胞可以為 E. coliRosetta(DE3)。但根據(jù)本領域公共知識，功能基因連接到各類載體獲得的重組載體， 轉入適當宿主細胞，在一定條件下均可實現(xiàn)目的蛋白的表達，因此本發(fā)明所述的大腸桿菌 宿主細胞并不局限于E. coliRosetta(DE3)。
[0025] 本發(fā)明所述的表達方法步驟(5)中所述的誘導表達培養(yǎng)的方法為：挑取生產(chǎn)菌株單 菌落接種于LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，獲得種子液；將上述種子液以1% (v/v)的接種量接 種于TB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3小時后，加入終濃度為0. 05mM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，30°C培養(yǎng) 16h。
[0026] 按照本發(fā)明所述的表達方法表達的生物素化無機焦磷酸酶可以根據(jù)所選用的大 腸桿菌表達載體上帶有的親和層析標簽，選擇相應的親和層析柱進行純化。當使用的大腸 桿菌表達載體為pMAL_p4E、pMAL_p4X、pMAL_p5E和pMAL_p5X時，可以選用Amylose親和層 析柱進行純化；當使用的載體為pET22b (+)、pET28a (+)、pET30a (+)和pET32a (+)時，可以 選用組氨酸親和層析柱進行純化。
[0027] 本發(fā)明的有益效果：
[0028] 本發(fā)明提供了一種生物素化無機焦磷酸酶的表達方法，該表達方法實現(xiàn)了無機焦 磷酸酶在宿主細胞內(nèi)的生物素化修飾。表達的生物素化無機焦磷酸酶的催化活力與未進 行融合表達的相同無機焦磷酸酶相比較，沒有發(fā)生變化。按照本發(fā)明提供的表達方法表達 的生物素化無機焦磷酸酶的產(chǎn)量達到21~38mg/100mL培養(yǎng)基；表達的生物素化無機焦磷 酸酶的比活力達到94. 2~151. 6U/mg ;表達的生物素化無機焦磷酸酶被磁珠固定后得到的 Bead-LUC被反復洗滌3次后，催化活力幾乎不受影響，被反復洗滌6次后，能夠維持相較于 洗滌前97%以上的相對活力，在反復洗滌9次后，能夠維持相較于洗滌前94%以上的相對 活力，在反復洗滌15次后，能夠維持相較于洗滌前91%以上的相對活力。
【附圖說明】
[0029] 圖1為插入了生物素受體蛋白BAP2