基,得到如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列,命名為序列 BAP23-3,化學(xué)全合成序列BAP23-3 ;
[0069] ⑵·用限制性內(nèi)切酶Nco I和EcoR I酶切pET30a(+)質(zhì)粒和實(shí)施例5步驟⑴所 得序列BAP23-3,并用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物,將酶切后的核苷酸序列BAP23-3 和pET30a(+)質(zhì)粒于16°C連接過夜,獲得重組表達(dá)載體A3 ;
[0070] ⑶.設(shè)計(jì)一對(duì)引物特異性引物,以PPASE重組質(zhì)粒為模版,PCR擴(kuò)增其中的無機(jī)焦 磷酸酶的編碼基因,其序列如SEQ ID NO :10所示,用PCR清潔試劑盒回收PCR產(chǎn)物;正向引 物的序列如SEQ ID NO :11所示,其酶切位點(diǎn)為EcoR I ;反向引物的序列如SEQ ID NO :12 所示,其酶切位點(diǎn)為Not I ;PCR程序?yàn)椋?5°C變性5min,94°C變性30s,55°C退火30s,72°C 延伸lmin,34個(gè)循環(huán),最后72°C延伸IOmin ;
[0071] ⑷.用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I酶切實(shí)施例5步驟⑶所得的純化后的無機(jī) 焦磷酸酶編碼基因和實(shí)施例5步驟⑵所得重組表達(dá)載體A3,將酶切后的無機(jī)焦磷酸酶編碼 基因和重組表達(dá)載體A3于16°C連接過夜,獲得重組表達(dá)載體B3 ;
[0072] (5).用實(shí)施例5步驟⑷所得重組表達(dá)載體B3轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 獲得重組基因工程菌A3 ;
[0073] (6).挑取實(shí)施例5步驟(5)所得重組基因工程菌A3單菌落接種于5mL含有終濃度 為50 μ g/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)24h,獲得種子液;將上述5mL種子液全 部接種于500mL含有終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)3小時(shí)后,加 入終濃度為0. 05mM的IPTG,30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)16h,表達(dá)結(jié)果如圖5所示。
[0074] 實(shí)施例6生物素化無機(jī)焦磷酸酶的純化
[0075] 按照實(shí)施例5的方法表達(dá)的生物素化無機(jī)焦磷酸酶,利用組氨酸親和層析柱進(jìn)行 純化。
[0076] 純化方法同實(shí)施例2 ;采用超微量蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定純化后的生物素化無機(jī)焦 磷酸酶的濃度,約為7. 2mg/mL。
[0077] 實(shí)施例7無機(jī)焦磷酸酶的固定化
[0078] 固定化方法:
[0079] 取10 μ L鏈親合素包被的磁珠混懸液Dynabeads M_280Streptavidin靜置于磁 鐵上 Imin 后,棄去上清液;用 50 μ L 洗滌緩沖液(0.1 M Tris-HCl (pH7. 9) +0. 5mM EDTA+5mM MgAc2+0. 4g/LPVP+0. 02% (W/v)BSA+lmM DTT)洗滌兩次后,用40 μ L洗滌緩沖液重懸磁珠; 加入10 μ L純化后的生物素化無機(jī)焦磷酸酶,混勻,4°C放置Ih后;置于磁鐵上,待磁珠完全 集中后棄去上清液,用洗滌緩沖液洗滌Bead-PPase兩次,最后將Bead-PPase重懸于10 μ L 洗滌緩沖液中。
[0080] 實(shí)施例8無機(jī)焦磷酸酶的活力測(cè)定
[0081] 顯色劑配制:將13g鉬酸銨溶解于IOOmL去離子水中,得到溶液A ;將0. 35g酒石 酸銻氧鉀溶解于IOOmL去離子水中,得到溶液B ;將溶液A、溶液B和硫酸溶液按3:3:1的體 積比混合均勻,得到顯色劑。
[0082] 測(cè)活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制不同濃度的磷酸根離子(P043 )標(biāo)準(zhǔn)溶液:0mM、 0. 008mM、0. 012mM、0. 016Mm、0. 024mM、0. 032mM ;分別向上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入終濃度為 0. 2% (w/v)的抗壞血酸,反應(yīng)30s;加入4% (v/v)的顯色劑混合均勾后,放置15min;于 700nm下測(cè)定吸光度A7。。。以吸光度A7。。對(duì)磷酸根離子濃度作圖,繪制測(cè)活標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖6 所示。
[0083] 無機(jī)焦磷酸酶的活力測(cè)定方法:將待測(cè)樣品加入500 μ L測(cè)活反應(yīng)液中(IOOmM pH8. 0的Tris-HCl+3mM MgCl2+100mM PPi)反應(yīng)15min;以檸檬酸終止反應(yīng)后,加入終濃度 為0. 2% (w/v)的抗壞血酸,反應(yīng)30s;加入4% (v/v)的顯色劑混合均勾后,放置15min;于 700nm下測(cè)定吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的磷酸根(P043 )的濃度。
[0084] 活力單位定義:在25°C下,Imin內(nèi),生成1 μ mol磷酸根(P043 )所需的酶量定義為 1個(gè)單位(Unit)。
[0085] 將按照實(shí)施例1的表達(dá)方法表達(dá)的生物素化無機(jī)焦磷酸酶編號(hào)為樣品1 ;
[0086] 將樣品1按照實(shí)施例7的固定化方法制得的Bead-PPase編號(hào)為樣品2 ;
[0087] 將樣品2用實(shí)施例7所述的洗滌緩沖液反復(fù)洗滌3、6、9和15次后的Bead-PPase 分別編號(hào)為樣品3、4、5、6 ;
[0088] 將按照實(shí)施例3的表達(dá)方法表達(dá)的生物素化無機(jī)焦磷酸酶編號(hào)為樣品7 ;
[0089] 將樣品6按照實(shí)施例7的固定化方法制得的Bead-PPase編號(hào)為樣品8 ;
[0090] 將樣品7用實(shí)施例7所述的洗滌緩沖液反復(fù)洗滌3、6、9和15次后的Bead-PPase 分別編號(hào)為樣品9、10、11、12。
[0091] 將按照實(shí)施例5的表達(dá)方法表達(dá)的生物素化無機(jī)焦磷酸酶編號(hào)為樣品13 ;
[0092] 將樣品13按照實(shí)施例7的固定化方法制得的Bead-PPase編號(hào)為樣品14 ;
[0093] 將樣品14用實(shí)施例7所述的洗滌緩沖液反復(fù)洗滌3、6、9和15次后的Bead-PPase 分別編號(hào)為樣品15、16、17、18。
[0094] 利用上述測(cè)定方法分別活性測(cè)定方法樣品1-18的相對(duì)活力,結(jié)果如下表:
[0095] 表1無機(jī)焦磷酸酶相對(duì)活力測(cè)定結(jié)果
[0097] 其中樣品1、樣品7和樣品13的相對(duì)活力指每mg蛋白的催化活力;其余樣品的相 對(duì)活力指每ULBead-PPase的催化活力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生物素化無機(jī)焦磷酸酶的表達(dá)方法,其特征在于:所述表達(dá)方法使用一種由23 個(gè)氨基酸殘基組成的生物素受體蛋白BAP23,將該生物素受體蛋白的編碼基因構(gòu)建到大腸 桿菌表達(dá)載體中,獲得一種攜帶上述生物素受體蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體,當(dāng)無機(jī)焦 磷酸酶的編碼基因構(gòu)建到上述重組表達(dá)載體中后,能夠表達(dá)該生物素受體蛋白和無機(jī)焦磷 酸酶的融合蛋白,該融合蛋白能夠在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)被生物素化修飾;其中,所述的生物素 受體蛋白BAP23的序列為SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。2. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述表達(dá)方法包括以下步驟: ⑴.合成生物素受體蛋白BAP23的編碼基因; ⑵.將步驟⑴合成的生物素受體蛋白BAP23的編碼基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體中, 獲得重組表達(dá)載體A; ⑶.將無機(jī)焦磷酸酶的編碼基因構(gòu)建到步驟⑵所得的重組表達(dá)載體A中,獲得重組表 達(dá)載體B; ⑷.用步驟⑶所得的重組表達(dá)載體B轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞,獲得重組基因工程菌A; (5).以步驟⑷所得的重組基因工程菌A作為生產(chǎn)菌株,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)。3. 如權(quán)利要求2所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述的表達(dá)方法步驟⑴中所述的生物 素受體蛋白BAP23的編碼基因?yàn)镾EQIDNO:2所示的核苷酸序列。4. 如權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述的表達(dá)方法步驟⑵中所述的 大腸桿菌表達(dá)載體為pMAL-p4E和pET30a(+)中的任意一種。5. 如權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述的表達(dá)方法步驟⑶中所述的大腸 桿菌表達(dá)載體為pMAL-p4E。6. 如權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述的表達(dá)方法步驟⑶中所述的大腸 桿菌表達(dá)載體為pET30a(+)。7. 如權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述的表達(dá)方法步驟⑶中所述的 重組表達(dá)載體B中的無機(jī)焦磷酸酶的編碼基因構(gòu)建于BAP23的編碼基因的上游或下游。8. 如權(quán)利要求7所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述的表達(dá)方法步驟⑶中所述的重組 表達(dá)載體B中:無機(jī)焦磷酸酶的編碼基因構(gòu)建于BAP23的編碼基因的上游。9. 如權(quán)利要求7所述的表達(dá)方法,其特征在于:所述的表達(dá)方法步驟⑶中所述的重組 表達(dá)載體B中的無機(jī)焦磷酸酶的編碼基因構(gòu)建于BAP23的編碼基因的下游。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種生物素化無機(jī)焦磷酸酶的表達(dá)方法,其中:使用一種由23個(gè)氨基酸殘基組成的生物素受體蛋白BAP23,將BAP23的編碼基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體中后,獲得重組表達(dá)載體,當(dāng)無機(jī)焦磷酸酶編碼基因插入到上述重組表達(dá)載體中后,表達(dá)的融合蛋白能夠在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)被生物素化修飾。按照本發(fā)明提供的表達(dá)方法表達(dá)的生物素化無機(jī)焦磷酸酶的產(chǎn)量達(dá)到21~38mg/100mL培養(yǎng)基;比活力達(dá)到94.2~151.6U/mg。表達(dá)的生物素化無機(jī)焦磷酸酶被磁珠固定后得到的Bead-LUC被反復(fù)洗滌3次后,催化活力幾乎不受影響;被反復(fù)洗滌15次后,仍能夠維持相較于洗滌前91%以上的相對(duì)活力。
【IPC分類】C12N9/14, C12N15/70
【公開號(hào)】CN105400749
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511024977
【發(fā)明人】高靜, 蔡亦梅, 吳超, 徐瀟, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風(fēng)
【申請(qǐng)人】北京中科紫鑫科技有限責(zé)任公司
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日