利用家蠶同時合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種家蠶合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一 種利用家蠶同時合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜘蛛種類繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112個科，3905個屬，44000多種。 蜘蛛絲是由蜘蛛絲腺分泌的一種天然高分子蛋白纖維，具有優(yōu)良的機(jī)械性能，如彈性好、強(qiáng) 度大、韌性強(qiáng)、耐高溫和低溫、耐沖擊、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等優(yōu)良特性， 其獨特的綜合性能是其他天然纖維和合成纖維所無法相比的。典型的蜘蛛絲有7種類型， 分別由7種不同絲腺分泌的不同的蛋白質(zhì)分子組成。其中由大囊狀腺（Major ampullate gland)分泌的主牽引絲（dragline silk)，呈放射狀分布，構(gòu)成蜘蛛網(wǎng)基本框架。牽引絲的 強(qiáng)度是鋼的5倍，因而擁有"生物鋼"之美譽(yù)。牽引絲的蛋白基因是高度保守的，主要由分 子量350kDa左右的、成對的牽引絲蛋白I(MaSpl)和牽引絲蛋白2 (MaSp2) 2種蛋白組成。
[0003] 黑寡婦蜘蛛（Latrodectus hesperus)牽引絲蛋白I (MaSpl)基因具有一個 單一外顯子，全長9390bp，編碼3129個氨基酸，基因含有大量的重復(fù)單元，每1個重 復(fù)單元由4種初級類型重復(fù)序列Typel、Type2、Type3和Type4通過頭尾串聯(lián)而成 (Typel-Type2-Type3_Type4)，而每1種初級類型重復(fù)序列都包含了典型的（GA)n、An和GGX 蛋白基序。MaSpl被認(rèn)為是牽引絲具有很強(qiáng)強(qiáng)度的主要分子基礎(chǔ)。
[0004] 黑寡婦蜘蛛（Latrodectus hesperus)牽引絲蛋白2 (MaSp2)基因具有一個單一外 顯子，全長11340bp，編碼3779個氨基酸，基因含有大量的重復(fù)單元，每一個重復(fù)單元主要 由2種初級類型重復(fù)序列以Typel-Typel-TypM串聯(lián)而成，而每一種初級類型重復(fù)序列都 包含了典型的An、GPGXX和GGX蛋白基序。MaSp2被認(rèn)為是牽引絲具有很強(qiáng)韌性的主要分 子基礎(chǔ)。
[0005] 由于蜘蛛絲自身的產(chǎn)量低，且由于其相互殘殺而不能通過大規(guī)模的飼養(yǎng)獲得批量 的蜘蛛絲，所以限制了蜘蛛絲的廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和對蜘蛛絲的編碼序 列及吐絲機(jī)理的深入了解，已有采用各種異源表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)蜘蛛絲蛋白的研究，異源表 達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母（Pichia pastoris)、昆蟲細(xì)胞（sf9、BmN)、倉鼠的腎臟細(xì)胞、轉(zhuǎn) 基因土豆、轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因山羊、轉(zhuǎn)基因老鼠、以及轉(zhuǎn)基因家蠶。
[0006] 但是，至今為止使用的各種異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來的蜘蛛絲蛋白1的分子量較 小，有較多重組蛋白缺少一些關(guān)鍵的蛋白基序，有較多蛋白不是純的蜘蛛絲蛋白分子，而是 與熒光蛋白等分子融合的融合蛋白，這些因素最終影響了外源蛋白的機(jī)械性能，而且至今 為止使用的各種異源表達(dá)系統(tǒng)都沒有表達(dá)過蜘蛛牽引絲蛋白2。因此，現(xiàn)有技術(shù)缺少了一種 方法能同時合成、分泌出黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2的蜘蛛絲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決【背景技術(shù)】中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提出了一種將能夠合成、分 泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2的轉(zhuǎn)基因家蠶品種雜交，育成雜交品種。另一方面進(jìn)一 步通過同蛾區(qū)陽性個體自交留種，選擇出2個牽引絲蛋白基因都純合的品種。利用轉(zhuǎn)基因 家蠶技術(shù)結(jié)合雜交育種技術(shù)，將黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2基因同時導(dǎo)入家蠶基因 組內(nèi)，并在家蠶絲腺細(xì)胞中特異表達(dá)，開發(fā)出能合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2 的家蠶，獲得以家蠶絲為本底的黑寡婦蜘蛛牽引絲，用于蜘蛛絲的開發(fā)利用，同時也可以用 于提高蠶絲的機(jī)械性能。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下：
[0009] (1)通過轉(zhuǎn)基因育成帶有紅色熒光DsRed標(biāo)記基因、能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽 引絲蛋白1的轉(zhuǎn)基因家蠶和帶有紅色熒光DsRed標(biāo)記基因、能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引 絲蛋白2的轉(zhuǎn)基因家蠶；
[0010] (2)將上述兩種轉(zhuǎn)基因家蠶品種雜交，育成Fl代雜交品種；
[0011] (3)將Fl代雜交品種同蛾區(qū)個體自交留種為F2代，F(xiàn)2代家蠶采用單蛾育，篩選出 熒光體視顯微鏡下表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因的家蠶飼養(yǎng)，采用同蛾區(qū)蠶蛾相互交配制 成F3代；
[0012] (4)F3代家蠶采用單蛾育，篩選出熒光體視顯微鏡下所有個體全部表達(dá)紅色熒光 DsRed標(biāo)記基因的蠶蛾在同一蛾區(qū)飼養(yǎng)，并同時采用Western Blot技術(shù)檢測，篩選出同時 表達(dá)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2的蛾區(qū)的蠶蛾相互交配制成F4代；
[0013] (5)F4代開始均采用與F3代同樣的方法飼養(yǎng)、篩選、制種，一直到F8代，育成兩個 黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白基因都純合的家蠶品種；
[0014] (6)通過家蠶絲腺細(xì)胞同時合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2,并隨家蠶 吐絲結(jié)繭行為進(jìn)入蠶繭。
[0015] 所述步驟（1)帶有紅色熒光DsRed標(biāo)記基因、能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋 白1的轉(zhuǎn)基因家蠶采用以下方式培育獲得：
[0016] Al)采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建pBac[3xP3-DsRed]-MaSpl質(zhì)粒作為在家蠶絲腺中 表達(dá)的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因載體，pBac [3xP3_DsRed]-MaSpl質(zhì)粒以piggyBac轉(zhuǎn)座 子為基礎(chǔ)包含外源基因的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因和作為標(biāo)記基因的紅色熒光DsRed 基因表達(dá)框；
[0017] A2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBaC[3XP3-DSRed]-MaSpl質(zhì)粒及能夠提供 piggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pHA3PIG按濃度比1 :1的比例導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后6小時以內(nèi)的 受精卵內(nèi)，利用pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl質(zhì)粒中的piggyBac轉(zhuǎn)座子將黑寡婦蜘蛛牽引絲 蛋白1基因插入到家蠶基因組內(nèi)；
[0018] A3)蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，然后與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配制種續(xù)代，此代為Gl代，在 Gl代蠶卵的轉(zhuǎn)青期，通過熒光體視顯微鏡觀察篩選出單眼表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因的 轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲再與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配制種續(xù)代成為G2代；
[0019] A4)G2代家蠶采用單蛾育，篩選出熒光體視顯微鏡下表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基 因的家蠶，采用同蛾區(qū)蠶蛾相互交配制成G3代；
[0020] A5)G3代家蠶采用單蛾育，同蛾區(qū)表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因的蠶蛾相互交配， 制成G4代；
[0021] A6)從G4代開始并經(jīng)連續(xù)3代采用紅眼表型純一的蛾區(qū)飼養(yǎng)、單蛾育和同蛾區(qū)蠶 蛾交配的相同方法進(jìn)行選擇和交配，育成紅眼基因和黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因純合、 能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的轉(zhuǎn)基因家蠶。
[0022] 所述的質(zhì)粒pBac[3xP3_DsRed]_MaSpl是以piggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)并帶有Amp 抗性基因，包括PiggyBac轉(zhuǎn)座子的兩個轉(zhuǎn)座臂PBL和PBR，以及兩個轉(zhuǎn)座臂之間的兩個 功能表達(dá)框，一個功能表達(dá)框是3 X P3啟動子啟動的紅色熒光蛋白基因表達(dá)框，即3 X P3 Promoter-DsRed-SV40,另一個功能表達(dá)框是包含家蠶絲素蛋白重鏈基因啟動子、絲素蛋 白重鏈基因信號肽、黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因和家蠶絲素蛋白重鏈基因3'末端的表達(dá) 框，艮P Fibroin H chain Promoter-Fibroin H chain signal peptide-MaSpI-Fibroin H chain PolyA0
[0023] 所述的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白I基因是包含2倍到16倍MaSpl基因重復(fù)單元 Typel_Type2-Type3_Type4,1 倍的 MaSp2 基因重復(fù)單元 Typel_Type2-Type3_Type4 喊基序 列如 SEQ ID Nd 1。
[0024] 所述步驟（1)帶有紅色熒光DsRed標(biāo)記基因、能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋 白2的轉(zhuǎn)基因家蠶采用以下方式培育獲得：
[0025] BI)采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建PBac[3xP3-DsRed]-MaSp2質(zhì)粒作為在家蠶絲腺中 表達(dá)的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因載體，pBac[3xP3-DsRed]_MaSp2質(zhì)粒以piggyBac轉(zhuǎn) 座子為基礎(chǔ)包含有作為外源基因的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因和作為標(biāo)記基因的紅色 熒光DsRed基因表達(dá)框；
[0026] B2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBaC[3XP3-DSRed]-MaSp2質(zhì)粒及能夠提供 piggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pHA3PIG按濃度比1 :1的比例導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后6小時以內(nèi)的 受精卵內(nèi)，利用pBac[3xP3-DsRed]_MaSp2質(zhì)粒中的piggyBac轉(zhuǎn)座子將黑寡婦蜘蛛牽引絲 蛋白2基因插入到家蠶基因組內(nèi)；
[0027] B3)蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，然后與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配制種續(xù)代，此代為G