-DsRed]-MaSp2X3 質(zhì)粒、 pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2X12 質(zhì)粒、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2X18 質(zhì)粒和 pBac [3xP3-DsRed] -MaSp2 X 24質(zhì)粒，其采用以下方式制備合成：
[0056] B. 1)先將家蠶絲素重鏈蛋白基因啟動子（Fib-H-P)連到pMD18-T simple(Takara)載體，并和基本的含有A3啟動子和綠色焚光蛋白表達框的piggyBac質(zhì)粒 piggy6212載體分別經(jīng)過Xhol/Ncol雙酶切，膠回收重鏈啟動子序列部分與piggyBac載體 骨架連接，獲得Piggy6609載體。
[0057] B. 2) pBac [3xP3-DsRed] -MaSp2質(zhì)粒構建方法和步驟如下：
[0058] 根據(jù)已經(jīng)報導的全長黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因（MaSp2)序列特征設計質(zhì)粒， 并根據(jù)家蠶的密碼子偏好性作了堿基優(yōu)化，詳細信息如下。
[0059] 人工合成家蠶絲素重鏈蛋白基因的信號肽、3倍的MaSp2基因重復單元序列、 MaSp2分子的C末端（其堿基序列如SEQ ID NO. 4)、家蠶絲素重鏈蛋白基因的C末端及其 PolyA的序列、以及后續(xù)載體構建所需的酶切位點序列，將這些序列連接到pUC57載體上， 命名為PUC4301質(zhì)粒，該質(zhì)粒含3倍MaSp2基因重復單元序列。
[0060] 將PUC4301質(zhì)粒分別利用2個同尾酶SpeI和NheI酶切，依次將不同倍數(shù)的重復 單元序列連接起來，通過疊加過程獲得含6倍、12倍、18倍和24倍MaSp2基因重復單元的 質(zhì)粒。
[0061] 將上述獲得的含有不同倍數(shù)的MaSp2基因重復單元序列的質(zhì)粒用NcoI/MunI雙 酶切，回收含有重復片段以及組成元件的序列片段，將上述已構建好的包含重鏈啟動子 和piggyBac骨架的載體Piggy6609用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切，回收包含piggyBac載 體骨架及重鏈啟動子序列元件的目的片段，分別與上述不同長度重復單元片段連接，獲得 piggy7471、piggy9433、piggyl0741 和 piggyl2049 載體。piggy7471 載體包含有 3 倍 MaSp2 基因重復單元序列，piggy9433載體包含有12倍MaSp2基因重復單元序列，piggyl0741載 體包含有18倍MaSp2基因重復單元序列，piggyl2049載體包含有24倍MaSp2基因重復單 元序列。
[0062] 將 piggy7471、piggy9433、piggyl0741 和 piggyl2049 載體分別用 Bglll/Aflll 雙酶切，分別回收包含有不同長度MaSp2基因重復單元和piggyBac載體骨架的目的片 段，對含有3XP3啟動子-紅眼基因表達框和A3啟動子-綠色熒光蛋白表達框的載體 piggy7785用同樣的酶切，回收1230bp含有3XP3啟動子和標記基因 DsRed編碼框的目的 片段，分別連接兩目的片段以加上DsRed標記基因，從而獲得pBac [3xP3-DsRed] -MaSp2 X 3 質(zhì)粒、口83(3[31?3-081^(1]-]\&15口2\12質(zhì)粒、口83(3[31?3-081^(1]-]\&15口2\18質(zhì)粒和 口8&。[3叉卩3-081^(1]-]\&15口2\24質(zhì)粒（圖5)。
[0063] B. 3)再將已構建的上述 pBac [3xP3_DsRed] -MaSp2 X 3 質(zhì)?；?pBac [3xP3_DsRed]_MaSp2X 24質(zhì)粒，與能夠提供piggyBac轉座酶的輔助質(zhì)粒pHA3PIG質(zhì)粒 (圖4)按1:1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為0. 4 μ g/ μ 1，質(zhì)粒溶解在pH = 7、0. 5mM的磷 酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導入家蠶產(chǎn)卵后6小時以內(nèi)的受精卵內(nèi)，導入總體積 為10nl。將顯微注射的蠶卵在25°C、85%濕度條件下飼養(yǎng)至成蟲，與非轉基因家蠶雜交傳 代，是為Gl代。在轉基因實驗的Gl代卵轉青期，通過熒光顯微鏡（Olympus，SZX12,日本） 觀察，分別獲得表達DsRed標志基因的、含3倍和24倍MaSp2基因重復單元的轉基因家蠶 3蛾和5蛾。
[0064] 將蠶飼養(yǎng)至成蟲與非轉基因家蠶雜交傳代，是為G2。自第G2代以后的轉基因家蠶 均采用單蛾育，在卵期通過熒光體視顯微鏡觀察，挑選表達DsRed標志基因的轉基因家蠶， 飼養(yǎng)至成蟲，同蛾區(qū)交配，使黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因純合，進而培育得到G3代、G4代。
[0065] 在G4代時，取5齡第3天家蠶后部絲腺細胞基因組DNA為模板，采用Inverse PCR 擴增黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因在家蠶基因組中的插入片段，對擴增片段進行克隆、測 序和染色體定位分析，結果顯示轉座子已經(jīng)插入到家蠶基因組內(nèi)。
[0066] 從G5代開始選擇紅眼基因型純合的蛾區(qū)飼養(yǎng)，采用同蛾區(qū)蠶蛾交配，育成紅眼基 因純合、后部絲腺細胞能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2的轉基因家蠶新品種，含3倍 和24倍MaSp2基因重復單元的轉基因家蠶分別定名為MASP2-3和MASP2-24。
[0067] 實施例1 :
[0068] 選取黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因已插入到家蠶基因組的第3染色體內(nèi)，并能夠 在后部絲腺細胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1，該蛋白能夠隨吐絲結繭行為進入蠶繭 的轉基因家蠶品種MASP1-2-1，以及黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因已插入到基因組的25號 染色體內(nèi)，并能夠在絲腺細胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2,該蛋白能夠隨吐絲結繭行 為進入蠶繭的轉基因家蠶家系MASP2-3-1，將這2個品種雜交，定名為MASP1-2X2-3。
[0069] 提取MASP1-2 X 2-3家蠶的繭絲蛋白為材料，采用SDS-PAGE電泳和黑寡婦蜘蛛牽 引絲抗體的Western blot技術分析轉基因家蠶MASP1-2 X 2-3蛋白的表達情況，結果得到 與預期分子量大小相符的2條特異性蛋白條帶。SDS-PAGE電泳條帶灰度分析顯示，黑寡婦 蜘蛛牽引絲蛋白1占蠶絲輕鏈含量高達2. 1%。黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2占蠶絲輕鏈含量 尚達1. 1 %。
[0070] 對轉基因家蠶絲的機械性能測定結果顯示，與野生型對照品種LanlO相比，最大 應力提高了 20. 5 %，最大應變提高9. 8 %，楊氏模量提高14. 0 %，韌性提高33. 9 %。
[0071] 研究結果證明黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2基因能夠同時在絲腺細胞合成分 泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2,這2個蛋白能夠隨吐絲結繭行為進入蠶繭，轉基因家 蠶絲的機械性能得到顯著改善。
[0072] 實施例2 :
[0073] 選取黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因已插入到家蠶基因組的第5染色體內(nèi)，并能夠 在后部絲腺細胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1，該蛋白能夠隨吐絲結繭行為進入蠶繭 的轉基因家蠶品種MASP1-12-1，以及黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因已插入到基因組的22號 染色體內(nèi)，并能夠在絲腺細胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2,該蛋白能夠隨吐絲結繭行 為進入蠶繭的轉基因家蠶家系MASP2-24-1，將這2個品種雜交，定名為MASP1-12X2-24。
[0074] 提取MASP1-12 X 2-24家蠶的繭絲蛋白為材料，采用SDS-PAGE電泳和黑寡婦蜘蛛 牽引絲抗體的Western blot技術分析轉基因家蠶MASP1-12 X 2-24蛋白的表達情況，結果 得到與預期分子量大小相符的2條特異性蛋白條帶。SDS-PAGE電泳條帶灰度分析顯示，黑 寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1占蠶絲輕鏈含量高達2. 2%。黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2占蠶絲輕鏈 含量高達1.4%。
[0075] 對轉基因家蠶絲的機械性能測定結果顯示，與野生型對照品種LanlO相比，最大 應力提高了 62. 3 %，最大應變提高30. 4 %，楊氏模量提高28. 1 %，韌性提高98. 9 %。
[0076] 研究結果證明黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2基因能夠同時在絲腺細胞合成分 泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1和蛋白2,這2個蛋白能夠隨吐絲結繭行為進入蠶繭，轉基因家 蠶絲的機械性能得到顯著改善。
[0077] 實施例3 :
[0078] 選取黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因已插入到家蠶基因組的第10染色體內(nèi)，并 能夠在后部絲腺細胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1，該蛋白能夠隨吐絲結繭行為進 入蠶繭的轉基因家蠶品種MASP1-16-8,以及黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因已插入到基 因組的22號染色體內(nèi)，并能夠在絲腺細胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2,該蛋白能 夠隨吐絲結繭行為進入蠶繭的轉基因家蠶家系MASP2-24-5,將這2個品種雜交，定名為 MASP1-16-8X2-24-5。
[0079] 提取MASP1-16-8 X 2-24-5家蠶的繭絲蛋白為材料，采用SDS-PAGE電泳和黑寡婦 蜘蛛牽引絲抗體的Western blot技術分析轉基因家蠶MASP1-16-8 X 2-24-5蛋白的表達情 況，