氨基）乙基）氨基甲?；┍交┌被姿?2, 5-二氧代吡咯烷-1-基酯溶液添加到釋放的聚糖樣品中并在室溫下放置5分鐘，在此期 間標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束。使用speedvac凍干標(biāo)記的樣品。凍干的樣品在使用HILICLC方法色 譜分離之前在60%乙腈/水溶液中重構(gòu)。如圖1和2中所示通過熒光和MS檢測分析樣品。
[0263] 本文中提供的分子的另外的用途
[0264] 吸光度檢測常用于蛋白質(zhì)作圖研究。常用于此用途的兩種不同的檢測方法是：a) 使用單波長檢測器在210-215納米的檢測；和b)使用光電二極管陣列（PDA)檢測器的寬 帶光譜檢測。在第一種方法中，所有肽吸收此波長，因此使用者可以確保檢測從該柱中洗脫 的所有肽。這種技術(shù)的一個困難在于多種多樣的化合物在此光譜區(qū)中吸收，必須極其小心 確保所有試劑、洗脫劑、玻璃器皿等極其干凈以確保觀察到的信號僅來自肽。在第二種方法 中，PDA檢測器以特定時間間隔收集洗脫劑的光譜（例如每秒收集在200至350納米之間 的光譜）。這提供比單波長更多的信號，因此有助于區(qū)分可能以類似的停留時間洗脫的肽。
[0265]肽作圖通常涉及消化蛋白中的痕量肽的定性和定量分析。復(fù)雜混合物中的肽的識 別和量化在本方法中通過三階段法實施：a)用雜環(huán)芳族氨基甲酸酯或其它反應(yīng)性基團(tuán)（它 們表現(xiàn)出比原始化合物更強(qiáng)的吸光度或熒光信號）標(biāo)記相關(guān)肽；b)分離衍生樣品；和c)通 過吸光度或熒光技術(shù)檢測衍生肽。衍生物的分離條件通常明顯不同于原料化合物的分離。 分離效率也對檢測方法具有嚴(yán)重影響。本雜環(huán)芳族氨基甲酸酯和/或類似反應(yīng)性基團(tuán)的使 用提供適用于納克量的蛋白質(zhì)的作圖法。此外，本文所述的方法提供增強(qiáng)用于檢測生物樣 品，如組織、尿液、血液和唾液中的肽的已知方法的靈敏度的手段。
[0266] 衍生劑選擇
[0267] 幾個標(biāo)準(zhǔn)對衍生方法的效用是重要的。分析程序必須提供復(fù)雜混合物中存在的各 組分的準(zhǔn)確量化。為了實現(xiàn)這一點(diǎn)，必須拆分相關(guān)組分，不僅互相拆分，還與衍生程序生成 的組分拆分。所有未衍生的聚糖和氨基酸（包括二級氨基酸）定量轉(zhuǎn)化成單一產(chǎn)物是非常 合意的并有利于良好量化。
[0268]檢測選擇性是氨基酸衍生物的另一有利特征。未衍生的氨基酸在低UV(200-220納米）范圍中都弱吸收，但在此波長的檢測受到樣品混合物或色譜流動相中存在的許多化 合物干擾。用吸收大約254納米的試劑衍生化提供選擇性測量，但生物樣品中常存在的任 何芳族有機(jī)化合物在此波長下會干擾。能夠借助熒光、電化學(xué)響應(yīng)或可見光范圍吸光度檢 測的試劑是優(yōu)異的檢測選擇性所需的。
[0269] 最后，衍生物必須足夠穩(wěn)定以便分離和檢測而沒有顯著降解。高度穩(wěn)定的衍生物 也有利，因為它們允許按需要重新分析樣品，而不用檢測另一樣品。
[0270]過去，已經(jīng)開發(fā)出許多衍生程序以便通過高效液相色譜分離和電泳分離檢測氨基 酸。常用于此用途的五種程序包括：
[0271] (1)鄰苯二甲醛（0ΡΑ)/硫醇法。該0ΡΑ程序可檢測具有大約100飛克分子（fmol) 數(shù)量級的典型可檢測水平的氨基酸。該衍生物的形成快速。這種方法的重要難點(diǎn)是加合物 相當(dāng)不穩(wěn)定并且必須在檢測步驟前不久制備。另一問題在于這一試劑不與二級氨基酸形成 衍生物。
[0272] (2)氯甲酸9-芴基甲酯（FM0C法）。該FM0C程序提供穩(wěn)定的衍生物，最低可檢出 水平為數(shù)百fmol數(shù)量級。該FM0S程序有許多缺點(diǎn)。不容易量化游離色氨酸和胱氨酸。必 須通過萃取步驟從反應(yīng)混合物中除去該衍生試劑，因為其本身是熒光的。該試劑還據(jù)報道 與組氨酸形成多重衍生物。該試劑在操作中也危險，因為其是腐蝕性的并且是催淚劑。
[0273] (3)異硫氰酸苯酯法（PITC)。PITC程序產(chǎn)生快速形成的穩(wěn)定衍生物。其可用于一 級和二級氨基酸以及胱氨酸。該方法使用吸光度作為檢測程序并可以提供lpmol的最低檢 測限。但是，該衍生物不是熒光的并且必須在254納米進(jìn)行檢測，這無法實現(xiàn)良好的檢測選 擇性。
[0274] (4)丹磺酰氯法。丹磺酰氯法提供穩(wěn)定的衍生物，最低檢測限為大約1. 5pmol的數(shù) 量級。能夠檢測仲胺和半胱氨酸，但其產(chǎn)生多重衍生物。
[0275] (5)熒光琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯已用作胺、氨基酸、肽、磷酸酯/鹽和其它種類 的化合物的衍生劑。當(dāng)使用琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯試劑標(biāo)記具有熒光基團(tuán)的化合物時， 可以實現(xiàn)大約lpmol的檢出限。這些試劑與現(xiàn)代分離技術(shù)，如高效液相色譜法、薄層色譜法 或毛細(xì)管電泳結(jié)合使用。Nimura等人，58Anal.Chem. 2372(1986)。已通過使碳環(huán)芳胺與 二-(N-琥珀酰亞胺基）碳酸酯反應(yīng)制備琥珀酰亞胺基活化的氨基甲酸酯。Takeda等人，24 TetrahedronLett·，4569(1983)〇
[0276] 多種樣品的HPLC分析用的現(xiàn)有衍生化學(xué)包括Waters'AccQTag氨基酸分析系統(tǒng)。 WatersAccQTag方法是肽和蛋白水解物氨基酸的柱前衍生技術(shù)。該AccQTag方法基于專門 為氨基酸分析開發(fā)的衍生劑。WatersAccQFluor試劑（6-氨基喹啉基-N-羥基琥?自酰亞胺 基氨基甲酸酯或ACQ)是N-羥基琥珀酰亞胺活化的雜環(huán)氨基甲酸酯一一已知類型的胺衍生 化合物。參見EP0533200B1。
[0277] 這種試劑將一級和二級氨基酸都轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的熒光衍生物并水解產(chǎn)生6-氨基喹 啉--非干擾副產(chǎn)物。該AccQFluor試劑與一級和二級氨基酸快速反應(yīng)以產(chǎn)生高度穩(wěn)定的 脲類，其在395納米發(fā)射強(qiáng)熒光。所得衍生物在室溫下穩(wěn)定最多1周。
[0278] 快速簡單的WatersAccQTag氨基酸分析方法的關(guān)鍵是衍生劑和簡單的柱前衍生 程序。WatersAccQFluorReagent是高反應(yīng)性化合物6-氨基喹啉基-N-羥基琥?自酰亞胺 基氨基甲酸酯（AQC)，其在數(shù)秒左右與一級和二級氨基酸形成穩(wěn)定衍生物。該衍生物容易通 過反相HPLC使用WatersAccQTag氨基酸分析系統(tǒng)在不到35分鐘內(nèi)分離。
[0279] 在反應(yīng)過程中消耗過量試劑形成氨基喹啉（AMQ)。AMQ具有與任何衍生的氨基酸 明顯不同的光譜性質(zhì)。這能將檢測器波長編程，其使該衍生物的光譜發(fā)射響應(yīng)最大化，同時 使AMQ的響應(yīng)最小化。該衍生程序-將試劑添加到適當(dāng)緩沖的樣品中并加熱-簡單直接。 可以直接注入氨基酸衍生物，而不用進(jìn)一步的樣品準(zhǔn)備。普通緩沖鹽和洗滌劑對反應(yīng)產(chǎn)率 或結(jié)果的可再現(xiàn)性幾乎沒有影響。
[0280] 多種樣品的HPLC分析用的衍生化學(xué)的另一實例是用于標(biāo)記N-連接聚糖的來自 Prozyme的InstantAB?試劑盒，例如Glyko?InstantAB?試劑盒（可獲自Prozyme，Inc.， Hayward，California)。InstantAB?提供快速標(biāo)記和強(qiáng)焚光，但產(chǎn)生弱MS信號。實際上， 與標(biāo)準(zhǔn)2-AB試劑相比，這一分子的MS信號顯著降低。
[0281] 在本文中提供了含有叔胺、熒光部分和反應(yīng)性官能團(tuán)的分子。某些其他分子可能 簡單地含有叔胺和反應(yīng)性官能團(tuán)。但是，所有分子都發(fā)生快速官能化。通過使用叔胺，所有 分子都是MS活性的（在質(zhì)譜法中活性），而另一些也是熒光的。
[0282] 下面是可用于質(zhì)譜用途并且是熒光的新型分子和試劑：
[0283]
[0284] (4-((2-(二乙基氨基）乙基）氨基甲?；┍交┌被姿?, 5-二氧代吡咯 烷-1-基酯
[0285] 如上所述，現(xiàn)有技術(shù)狀況利用1)極慢反應(yīng)并產(chǎn)生良好MS/熒光信號或2)快速反 應(yīng)并具有良好熒光信號但具有差MS信號的標(biāo)記分子。在目前快速反應(yīng)分子中缺乏MS信號 被認(rèn)為歸因于缺乏富電子胺-所存在的任何氮作為脲或氨基甲酸酯官能的一部分損失電 子密度。在此，我們將氨基或其它MS活性原子添加到快速反應(yīng)體系的熒光部分中，或?qū)⒎?應(yīng)性官能團(tuán)添加到慢反應(yīng)（高熒光和MS信號）體系中以降低反應(yīng)時間（從數(shù)小時降至數(shù) 秒）。
[0286] 可與本文所述的分子結(jié)合使用的其他熒光部分包括香豆素一一常用于標(biāo)記氨基 酸的一類重要的含氧熒光團(tuán)。香豆素是具有如下的基礎(chǔ)分子結(jié)構(gòu)的各種取代香豆素：
[0287]
[0288] -個具體實例是香豆素7(3-(2苯并咪唑基）-7_N，N-二乙基氨基香豆素），其 中紅色R基團(tuán)（母體香豆素上的H)可以是異氰酸酯、0-琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯或其它 胺反應(yīng)性基團(tuán)。
[0289] 另一實例是使用羰基作為用于連接反應(yīng)性部分的官能團(tuán)的官能化香豆素334(2， 3,5,6-1Η，4Η-四氫-9-乙?；翰?[9,9a，l-gh]_香豆素）。
[0290]
[0291] 下列尼羅紅衍生物也通過酚基官能化以產(chǎn)生胺反應(yīng)性基團(tuán)。
[0292]
[0293] 尼羅紅衍生物
[0294] 可用作熒光部分的香豆素的其他實例包括：
[0295] 香豆素4 (7-羥基-4-甲基香豆素）；
[0296] 香豆素120 (7-氨基-4-甲基香豆素）；
[0297] 香豆素2 (7-氨基-4-甲基香豆素）；
[0298] 香豆素466 (7-二乙基氨基香豆素）；
[0299] 香豆素47 (7-二乙基氨基-4-甲基香豆素）；
[0300] 香豆素 102(2,3,5,6-1H，4H-四氫-8-甲基喹嗪并-[9,9a，l-gh]_ 香豆素）；
[0301] 香豆素152A(7-二乙基氨基-4-三氟甲基香豆素）；
[0302] 香豆素152 (7-二甲基氨基-4-三氟甲基香豆素）；
[0303] 香豆素151 (7-氨基-4-三氟甲基香豆素）；
[0304] 香豆素 6H(2,3,5,6-1H，4H-四氫喹嗪并-[9,9a，Ι-gh]香豆素）；
[0305] 香豆素307 (7-乙基氨基-6-甲基-4-三氟甲基香豆素）；
[0306] 香豆素500 (7-乙基氨基-4-三氟甲基香豆素）；
[0307] 香豆素314(2,3,5,6-1!1，4!1-四氫-9-乙氧甲?；翰?[9,93，1111]香豆素） ；
[0308] 香豆素 510(2,3,5,6-1J-4H-四氫-9-(3-吡啶基）-喹嗪并-[9,9a，l-gh]香豆 素）；
[0309] 香豆素30(3-2' -N-甲基苯并咪唑基）-7-N，N-二乙基氨基香豆素）；
[0310] 香豆素552 (N-甲基-4-三氟甲基哌啶并-[3, 2-g]-香豆素）；
[0311] 香豆素6(3-(2' -苯并噻唑基）-7-二乙基氨基香豆素）；和
[0312] 香豆素153(2,3,5,6-1H，4H-四氫-8-三氟甲基喹嗪并-[9,9a，l-gh]香豆素）。
[0313] 羅丹明也可用作熒光部分。羅丹明染料基于具有如下基礎(chǔ)分子結(jié)構(gòu)的熒光酮分 子：
[0314]
[0315] 并包括下列實例：
[0316] 羅丹明110(〇-(6_氨基-3-亞氨基-3H-咕噸-9-基）-苯甲酸）；
[0317] 羅丹明19(苯甲酸，2-[6_(乙基氨基）-3-(乙基亞氨基）-2,7_二甲基-3H-咕 噸-9-基]，尚氣酸鹽）；
[0318] 羅丹明6G(苯甲酸，2-[6-(乙基氨基）-3-(乙基亞氨基）-2,7_二甲基-3H-咕 噸-9-基]-乙基酯，單鹽酸鹽）；
[0319] 羅丹明B(2-[6-(二乙基氨基）-3-(二乙基亞氨基）-3H-咕噸-9-基]苯甲酸）；
[0320] 羅丹明 101 (8- (2-羧基苯基）-2, 3, 5,6,11，12,14,15-八氫-1H，4H，10H，13H-二 喹嗪并[9,9a，Ι-bc:9'，9a'，Ι-hi]咕噸鑰高氯酸鹽）。
[0321] 如下所示的熒光素也可用作熒光部分：
[0322]
[0323] 熒光素的實例包括：
[0324] Uranin(熒光素二鈉）；和
[0325] 熒光素27 (2, 7-二氯熒光素）
[0326] 簡言之，本文所述的MS活性的熒光快速標(biāo)記聚糖分子可以利用不同的其它熒光 部分代替式I和Π的苯甲酰胺結(jié)構(gòu)。
[0327] 例如，可以與官能團(tuán)和MS活性原子一起使用以制造MS活性的快速標(biāo)記分子的其 它熒光部分包括如下即將所示的聯(lián)苯基、苯基、萘基-取代的噁二唑部分。
[0328]
[0329] 實例包括：
[0330] 丁基^^0(2-(4-聯(lián)苯基）-5-(4-叔丁基苯基）-1，3,4-噁二唑）；
[0331]PBD(2-(4-聯(lián)苯基）-5-苯基-1，3,4-噁二唑）；和
[0332] 880(2,5-雙-(4-聯(lián)苯基）-1，3,4_噁二唑）。
[0333] 類似地，苯基取代的噁唑類（下面立即顯示）和呋喃類（未顯示）可用作熒光部 分。
[0334]
[0335] 此類部分的實例包括：
[0336] ΡΡ0 (2, 5-二苯基噁唑）；
[0337] α -ΝΡ0 (2- (1-萘基）-5-苯基噁唑）；
[0338] ΒΒ0 (2, 5-雙-(4-聯(lián)苯基）-噁唑）；和
[0339] ?0?0?(1，4-二[2