荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蒸枝（LitchichinensisSonn.)是我國重要的南方熱帶亞熱帶果樹，種植資源十 分豐富，具有很高的食用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，可食部分為假種皮，可食率因?yàn)槠贩N的不同而有 著很大的差別。果實(shí)中核（即種子）大是影響荔枝果實(shí)品質(zhì)的突出問題之一，荔枝的種胚 敗育即"焦核"是荔枝果實(shí)發(fā)育過程中常見的一種遺傳現(xiàn)象，焦核果可食率高，口感也比大 核果好，焦核率是評估荔枝品質(zhì)的一個(gè)非常重要的指標(biāo)。
[0003]目前栽培的優(yōu)質(zhì)荔枝品種如廣東的糯米糍、桂味，福建的蘭竹、綠荷包，廣西的靈 山香荔等，均以焦核為特征。然而，迄今為止學(xué)界對荔枝種胚敗育的機(jī)制研究尚停留在組織 結(jié)構(gòu)觀察和生理生化變化的層面上，種胚敗育的內(nèi)在分子機(jī)制還沒有完全清楚。
[0004] 胚胎發(fā)育的任一方面，如花粉、胚囊、胚和胚乳等發(fā)育過程受阻都可能引起種子敗 育。在荔枝種子的發(fā)育過程中，糖分不能在胚乳中正常代謝和積累與其敗育有著重要的聯(lián) 系，現(xiàn)有研究中細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性與玉米、蠶豆、大麥、大米以及番茄等植物種類種子 發(fā)育呈正相關(guān)，缺少細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)降低了玉米和大米種子的貯藏物質(zhì)儲(chǔ)存過 程，番茄細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制物基因沉默后（即增加CWAI活性），番茄種子的尺寸變大。 Wang和Ruan通過對棉花GhCWINl在種子發(fā)育早期的時(shí)空表達(dá)模式研究，發(fā)現(xiàn)GhCWINl基因 在胚乳的早期發(fā)育階段（游離核時(shí)期）起重要作用。這些研究都說明了細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶 在種子發(fā)育過程中有著的重要的作用。申請人通過前期研究發(fā)現(xiàn)荔枝的種胚發(fā)育與荔枝中 的酸性轉(zhuǎn)化酶相關(guān)，但現(xiàn)有技術(shù)中還沒有克隆出荔枝相關(guān)酸性轉(zhuǎn)化酶基因，荔枝種胚研究 機(jī)制無法在分子機(jī)制層面展開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供荔枝細(xì)胞壁酸 性轉(zhuǎn)化酶基因。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述酸性轉(zhuǎn)化酶基因的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：
[0008]荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAIl，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5， 其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~5所示。
[0009] 所述荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4， LcCWAI5所編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:6~10所示。
[0010] 本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增所述荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2， LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5 的引物，其引物序列如SEQIDNO:11 ~20 所示。
[0011] 本發(fā)明還提供含有權(quán)利要求1所述荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAI1，LcCWAI 2,LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5 的表達(dá)載體。
[0012] 申請人通過基因沉默表達(dá)的方法，對荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAI1， LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)沉默表達(dá)荔枝細(xì)胞壁酸 性轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5能夠引起荔枝種胚敗 育，從而提尚森枝焦核率。
[0013] 因此，本發(fā)明還保護(hù)所述基因或所述表達(dá)載體在提高荔枝焦核率方面的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)所述基因或所述表達(dá)載體在制備提高荔枝焦核率的制劑方面的應(yīng) 用。
[0015] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用是構(gòu)建LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4 或LcCWAI5 的 沉默表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌獲得農(nóng)桿菌工程菌，以所述農(nóng)桿菌工程菌作為浸染液浸染荔枝 植株。
[0016] 更優(yōu)選地，所述農(nóng)桿菌工程菌的0D6。。為0· 7~1. 4。
[0017] 更優(yōu)選地，所述荔枝植株為盛花期的植株或花后3周前內(nèi)結(jié)有幼果的植株。
[0018] 優(yōu)選地，所述荔枝品種為黑葉、白荔、早紅、馬貴荔等大核品種。
[0019] 優(yōu)選地，所述浸染荔枝植株的方式為噴灑、浸沒、注射。
[0020] 更優(yōu)選地，對于不同的荔枝品種，所述浸染液的浸染方式有所不同，例如，可以在 荔枝盛花期浸染花穗，也可以通過注射的方式將浸染液注射入荔枝果柄或種柄。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] 本發(fā)明首次克隆出5荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因，分別命名為LcCWAI1、LcCWAI 2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,長度分別為 1713bp、1722bp、1734(1758)bp、1677bp和 1740bp，編碼的氨基酸數(shù)目分別為570、573、577 (585)、558、579個(gè)；通過基因沉默技術(shù)證 明，沉默所述酸性轉(zhuǎn)化酶基因能夠提高荔枝焦核率，在生產(chǎn)上有著廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0023]圖1為部分荔枝組織RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道1~4為荔枝葉片 樣品，泳道5~8為蒸枝種皮樣品，泳道9~12為蒸枝種柄樣品，泳道13~14為蒸枝花的 樣品，泳道15~16為荔枝種仁樣品。
[0024] 圖2荔枝和其他植株種類CWAI基因進(jìn)化樹分析。
[0025]圖3為荔枝LcCWAIs擴(kuò)增結(jié)果；其中，S代表擴(kuò)增序列（sequence)，Μ代表DNA長 度標(biāo)記（Marker)。
[0026] 圖4為荔枝LcCWAIs在不同品種間的單核苷酸突變，其中，HY:黑葉；NMC:懦米糍； FZX:妃子笑。
[0027] 圖5為LcCWAIs氨基酸序列與其他物種的同源性比較。
[0028] 圖6為LcCWAIs蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型㈧和功能位點(diǎn)預(yù)測（B);圖6A和圖6B按順 序從左到右依次是LcCWAI1、LcCWAI2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5 編碼的蛋白。
[0029] 圖7為LcCWAIs不同組織的表達(dá)；數(shù)據(jù)點(diǎn)上的線段為標(biāo)準(zhǔn)誤（η= 3)。
[0030] 圖8為TRVl(a)和TRV2(b)結(jié)構(gòu)示意圖；其中，RdRP為RNA依賴的RNA聚合酶；16K 為富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp為運(yùn)動(dòng)蛋白；Cp為衣殼蛋白；MCS為多克隆位點(diǎn)。
[0031] 圖9為不同濃度菌液種柄和果柄注射對"黑葉"和"白荔"種胚發(fā)育的影響，其中， ODOO. 7 是 0D6QQ= 0. 7,其它類似。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語 與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的意義相同。
[0033] 實(shí)施例1酸性轉(zhuǎn)化酶基因篩選和克隆
[0034] 一、荔枝樣品RNA的提取以及質(zhì)量檢測
[0035] 采用華越洋超快型RNA提取試劑盒（具體方法參照說明書）對"妃子笑"、"黑葉" 和"糯米糍"蒸枝的葉片、花、果皮、果蒂、種皮、種仁等組織的RNA進(jìn)行提取，RNA的濃度用紫 外核酸蛋白檢測儀，取1μ1測定260nm與280nm的比值，若介于1. 80~2. 00之間則可以 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。如果RNA濃度較高，可以稀釋一定倍數(shù)后檢測。
[0036] 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，可以看出RNA呈現(xiàn)出清晰的28S和18S兩條帶， 并且28S的亮度是18S的兩倍左右，沒有拖尾現(xiàn)象，無DNA污染。表明提取的RNA質(zhì)量比較 高，無明顯降解，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。
[0037] 二、細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因的篩選和聚類分析
[0038] 根據(jù)荔枝基因組測序結(jié)果，調(diào)出注釋為Cellwallinvertase的相關(guān)基因（一共 14個(gè)），經(jīng)NCBI比對（與其他物種中相關(guān)酸性轉(zhuǎn)化酶基因比對）和生物信息學(xué)分析軟件分 析，利用MEGA5進(jìn)行聚類分析后刪除同源性較差的個(gè)別成員，用生物信息學(xué)在線分析網(wǎng)站 Smart工具（http://smart.embl-heidelberg.de/)刪除掉一些不具備完整功能或者基因 組注釋錯(cuò)誤的成員，最后篩選出5個(gè)結(jié)構(gòu)完整，與細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶的氨基酸保守功能域 一致的基因LcCWAIs(表1，轉(zhuǎn)化酶基因Genbank分類號(hào)見表2)，分別為LcCWAI1、LcCWAI 2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,對荔枝和5個(gè)其他品種已報(bào)道的CWAI、SAI和細(xì)胞質(zhì)中 性/堿性轉(zhuǎn)化酶（NI)基因用MEGA5進(jìn)行聚類分析（圖2)，可以看出基因LcCWAIs大致聚 成三類，NI基因聚成一類，液泡酸性轉(zhuǎn)化酶聚成一類，CWAI的5