個(gè)基因和其他物種已報(bào)道的 細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因聚在一起，表明篩選出的基因確實(shí)是CWAI基因。荔枝的CWAI又被 歸成三小類。其中LcCWAIl聚成一類，LcCWAI2聚成一類，LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5比較 相近聚成一類。
[0039] 表1荔枝細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAIs的基本信息
[0040]
[0041]表2用于進(jìn)化樹構(gòu)建的轉(zhuǎn)化酶類基因GeneBank分類號(hào)
[0044] 三、細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAIs的克隆和信號(hào)肽分析
[0045] (一）LcCWAIs克隆
[0046] 分別提取"黑葉"、"妃子笑"和"糯米糍"葉片的RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，之后利用M-MLVFirstcDNASynthesisKit(invitrogen公司）以cDNA為模板，根據(jù) 蒸枝基因組測(cè)序結(jié)果中LcCWAIs的全長(zhǎng)序列，用PrimerPremier5. 0軟件分別于其起始子 和終止子處設(shè)計(jì)引物（引物序列如表3,委托生工生物工程（上海）有限公司合成），擴(kuò)增 目的基因的全長(zhǎng)；使用東洋紡生物科技有限公司的KOD-Plus-NeoTaq聚合酶，具體反應(yīng)體 系參照說明書。擴(kuò)增條件為94°C，2min;98°C，10s，55°C(其中LcCWAIl退火溫度為57°C)， 3〇8,72°(：，21^11，35個(gè)循環(huán)；72°(：，1〇1^11。反應(yīng)結(jié)束后取2以1跑膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否正確。
[0047] 表3荔枝LcCWAIs基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增引物
[0050] (二）PCR產(chǎn)物加A和目的基因的回收
[0051] 由于K0D為平末端聚合酶，為進(jìn)行TA克隆需在PCR產(chǎn)物的3'端加一個(gè)A，因此對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行加A孵育，反應(yīng)體系為Ο.?μLExTaq，3yllOXExTaqBuffer(TaKaRa)，在 72°C孵育半小時(shí)。
[0052] 根據(jù)目的片段的特異性來決定是進(jìn)行產(chǎn)物純化還是切膠回收，若目的片段特異， 采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（生工生物），具體方法參見試劑盒說明書。若目的片段不特異， 將產(chǎn)物全部進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳，用手術(shù)刀在紫外燈下進(jìn)行切膠，然后用DNA凝膠回 收試劑盒（生生生物）進(jìn)行回收，具體方法參加試劑盒說明書?；厥胀瓿珊?，取2μ1跑膠 檢測(cè)。
[0053](三）載體連接與轉(zhuǎn)化
[0054] 取適量檢測(cè)正確的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T(TaKaRa)進(jìn)行連接，目的片段與 克隆載體的摩爾比控制在3~5:1之間。連接體系包括1μ119-Τvector、適量純化后的 PCR產(chǎn)物、5ylLigationsolutionI(TaKaRa)，加雙蒸水補(bǔ)至10μ1，混勾后在16°C條件下 恒溫連接過夜。
[0055] 將感受態(tài)細(xì)胞DH5a(Vazyme)從_80°C取出并置于冰上融化，將2μ1連接產(chǎn)物加 入到30μ1感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕敲打，冰浴30min，然后于42°C水浴熱擊90s，取出置冰上 穩(wěn)定3min左右后加入不加抗生素的S0C培養(yǎng)基500μ1，37°C震蕩培養(yǎng)lh。4000rpm離心 3min，留下約100μ1上清，用槍頭將菌體重懸浮后涂于含有100μgml 的LB平板上， 37 °C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。
[0056] 用滅菌的牙簽從平板上挑取單菌落接種于含有100μgml 的LB液體培養(yǎng)基 中，在37 °C恒溫震蕩搖床震蕩培養(yǎng)6~8h后，跑菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆。菌液PCR方法為： 在PCR管中加入8μ1水，1μ1菌液混勻后在100°C條件下加熱5min，待恢復(fù)室溫后，往PCR 管里加入2μ1 10XBuffer，0.8yl2.5mMdNTPs，0.2ylrTaq酶，擴(kuò)增條件為95°C30s， 55°C30s，72°C2min。擴(kuò)增結(jié)束取2μ1產(chǎn)物跑膠檢測(cè)，挑取擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小正確的送去 測(cè)序（測(cè)序委托艾基生物技術(shù)有限公司完成），最終克隆獲得LcCWAIs。
[0057](四）信號(hào)肽預(yù)測(cè)
[0058]擴(kuò)增到LcCWAIs的全長(zhǎng)序列，對(duì)它們?cè)贓xPASy translate tool (http:// web. expasy. org/translate/)進(jìn)行番面譯分析和在SignalP(http://www. cbs. dtu. dk/ services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn)LcCWAI1不能正確翻譯成蛋白，具有信號(hào)肽。
[0059] 四、LcCWAIs序列分析及氨基酸序列理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)
[0060] 對(duì)LcCWAI1DNA序列（如SEQIDN0 :1所示）進(jìn)行分析，最終擴(kuò)增到1731bp的 序列，對(duì)其在ExPASyProtParamTool(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到其編碼570個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為 64. 5kD，等電點(diǎn)為5. 65。
[0061]LcCWAI2的全長(zhǎng)序列（如SEQIDN0 :2所示）為1722bp，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行預(yù) 測(cè)分析得到其編碼573個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為64. 6kD，等電點(diǎn)為9. 11。
[0062] 不同品種間LcCWAI3有一定的差異，"黑葉"中LcCWAI3全長(zhǎng)序列（如SEQID NO:3所示）1758bp，其余兩個(gè)品種LcCWAI3的序列為1734bp，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析 得到，"黑葉"的LcCWAI3編碼585個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為66.lkD，等電點(diǎn)為8. 58。 其余兩個(gè)品種中LcCWAI3編碼577個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為65. 2kD，等電點(diǎn)為8. 79。
[0063]LcCWAI4cDNA全長(zhǎng)（如SEQIDN0 :4所示）為1677bp，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行預(yù) 測(cè)分析，得到其編碼558個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為62. 7kD，等電點(diǎn)為6. 84。
[0064] LcCWAI 5 cDNA全長(zhǎng)（如SEQ ID N0 :5所示）為1740bp，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行預(yù) 測(cè)分析，得到其編碼579個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量65. 6kD，等電點(diǎn)為8.95。
[0065] 表4LcCWAIs理化特性分析
[0068] 五、目的基因的比對(duì)以及生物信息學(xué)分析
[0069]把克隆出的5個(gè)LcCWAIs基因的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖4)，這些基因均編碼約 570~590個(gè)氨基酸，在N端均含有一個(gè)長(zhǎng)度約為19~28的信號(hào)肽。與擬南芥、煙草、玉米 等物種的已知的細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶和液泡酸性轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，酸性轉(zhuǎn)化酶都 包含有NDPNG、WECXD這兩個(gè)酸性轉(zhuǎn)化酶類保持的功能位點(diǎn)，還包含有一個(gè)RDP保守的糖基 化位點(diǎn)。荔枝的細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶和擬南芥的細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶有68%的同源性，而與液 泡酸性轉(zhuǎn)化酶的同源性只有45% (圖5)。
[0070] 六、LcCWAIs氨基酸序列的生物信息學(xué)分析
[0071]CWAI是一種定位在細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)，屬于外泌蛋白，在其氣基酸序列的N端有 一段信號(hào)肽序列引導(dǎo)成熟的氨基酸序列定位到胞外。用ExPASytools(TargetP,SignalP和 THMMM)來預(yù)測(cè)細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶的亞細(xì)胞定位，從預(yù)測(cè)結(jié)果得到，5個(gè)CWAI蛋白均有信號(hào) 肽，定位于分泌通路，置信度為1 (最強(qiáng)），即結(jié)果可信。信號(hào)肽剪切位置分別位于第28位， 19位，26位，19位，27位氨基酸上，從跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果可知，CWAI蛋白均位于膜外。
[0072]通過 3 級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具（Phyrehttp://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/)對(duì) CWAI蛋白的3級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，所用模板為擬南芥細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶晶體結(jié)構(gòu)，PDB號(hào)為 C2AC1A_，同源度達(dá)58~70%，預(yù)測(cè)可信度達(dá)100%，說明預(yù)測(cè)的3D結(jié)構(gòu)可信。結(jié)果如圖 6A，從預(yù)測(cè)結(jié)果來看，5個(gè)CWAI蛋白3D結(jié)構(gòu)類似。圖6B為蛋白的功能位點(diǎn)，紅色表示與模 板相同，綠色表示為新的功能位點(diǎn)，由于LcCWAIl的一個(gè)功能位點(diǎn)發(fā)生了缺失突變（NDPNG 變?yōu)镹NG)，產(chǎn)生了一個(gè)新的功能位點(diǎn)。
[0073] 實(shí)施例2荔枝LcCWAIs基因的表達(dá)分析
[0074] 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)所獲得的5個(gè)LcCWAIs基因進(jìn)行組織特異性分析，可以 發(fā)現(xiàn)5個(gè)細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因存在著明顯組織特異性（圖7)。其中LcCWAIl在各個(gè)組織 中都有表達(dá)，其中在"妃子笑"大部分組織表達(dá)比其余兩個(gè)品種高，除了雄花外，"糯米糍"的 表達(dá)明顯比其余兩個(gè)品種低但在源器官（葉子）中的表達(dá)量相對(duì)最高；LcCWAI2主要在 種皮和種胚中的表達(dá)量最高，在成熟葉和雄花中"糯米糍"中的表達(dá)量低于其它兩個(gè)品種， 其它組織無規(guī)律性的差異；LcCWAI3主要在成熟葉和花器官中表達(dá)；除種柄和種仁外，其 余組織的LcCWAI4均高表達(dá)；LcCWAI5主要在雄花和雌花中有顯著表達(dá)，表達(dá)量很高，約 是其他組織的400~1000倍。
[0075] 荔枝中Lc