pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在聯(lián)合輻射抗腫瘤中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及腫瘤基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達(dá) 質(zhì)粒的構(gòu)建及聯(lián)合輻射抗腫瘤應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤在當(dāng)代是威脅人類健康的主要原因之一。目前，放射治療仍然是臨床治 療腫瘤的主要方法之一。放射治療隨著放射物理學(xué)及放射生物學(xué)的不斷發(fā)展，幾十年來其 療效已經(jīng)取得到巨大提高。但放療仍然存在其自身的缺點和困難，例如，放療后腫瘤的復(fù)發(fā) 和轉(zhuǎn)移，放療對自身正常組織的損傷等，對腫瘤患者的生存造成威脅。惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機 制十分復(fù)雜，是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段及多基因的復(fù)雜疾病，單一療法療效往往欠佳， 因此腫瘤綜合治療仍然是當(dāng)今腫瘤防治研究的熱點。近年來隨著分子生物學(xué)研究的迅速發(fā) 展及"人類基因組計劃"的實施，基因治療越來越受到人們的極大關(guān)注。特別是基因療法和 放射治療聯(lián)合治療給腫瘤患者重生帶來希望。
[0003]腫瘤的基因-放射治療(gene-radiotherapy)是近年來興起的、有效解決放射治療 和基因治療各自的難點和薄弱環(huán)節(jié)的綜合治療腫瘤的新方法?；?放射治療理論的確立 為腫瘤放射治療和基因治療的結(jié)合開辟了新途徑。特別是隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展、有效 治療基因的篩查和表達(dá)調(diào)控的進(jìn)一步研究，為腫瘤基因放射治療的探索提供了科學(xué)的研究 方向。
[0004] 美國哈佛大學(xué)和芝加哥大學(xué)的研究者最早進(jìn)行了腫瘤基因治療聯(lián)合放射治療的 實驗研究，將治療基因克隆于可被輻射誘導(dǎo)激活的Egr-Ι啟動子下游，通過轉(zhuǎn)染，將具輻射 誘導(dǎo)表達(dá)特性的治療基因轉(zhuǎn)入瘤體內(nèi)，在對腫瘤實施局部放療時誘導(dǎo)腫瘤殺傷基因的表 達(dá)，形成射線和基因?qū)δ[瘤的雙重殺傷作用。一方面可以相對降低有效照射劑量，緩解正常 組織的損傷；另一方面通過射線的局部照射來實現(xiàn)腫瘤殺傷基因的定位表達(dá)，對治療基因 的表達(dá)進(jìn)行時空調(diào)控。以往的實驗結(jié)果表明，下游治療基因的選擇對實現(xiàn)這一治療方案，提 高基因-放射治療效果至關(guān)重要。
[0005] 共刺激分子B7是參與T細(xì)胞活化的重要粘附分子，表達(dá)于大部分抗原遞呈細(xì)胞表 面，與T細(xì)胞表面的CD28相互作用使IL-2等淋巴因子的mRNA轉(zhuǎn)錄增強，為激發(fā)T細(xì)胞免疫反 應(yīng)提供第二信號，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞不表達(dá)B7分子，因而逃避了免疫細(xì)胞的監(jiān)視。IL-18又稱 干擾素γ誘生因子(IGIF)，具有抗感染、抗腫瘤、抗超敏反應(yīng)等作用。目前IL-18在腫瘤治療 中的意義的研究已成為新的熱點，認(rèn)為IL-18通過細(xì)胞毒作用、參與粘附分子調(diào)節(jié)、抑制腫 瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用。實踐表明，單一一種基因治療作用較弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] (一)解決的技術(shù)問題
[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 及其在聯(lián)合輻射抗腫瘤中的應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建了雙基因共表達(dá)質(zhì)粒pEgr-IL18-B7.2,通過 雙基因載體，把有抗腫瘤作用的IL18基因及共刺激分子B7-2基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，在分子水 平檢測IL18及B7.2表達(dá)顯著增高，表現(xiàn)了比單純放療更加顯著的抑瘤效果，還可明顯提高 免疫力，機體抑瘤能力顯著增高。
[0008] (二)技術(shù)方案
[0009] 為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0010] 一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建，包括以下步驟：
[0011] S1、取PIRES載體，用Xbal及Smal酶切，另取連接B7-2基因的T載體，用PstI酶切，得 到pIRES載體和B7-2基因片斷，粘端補平，然后把B7-2基因連接到pIRES上，得到第一中間 質(zhì)粒PIRES-B7-2;
[0012] S2、分別用BamHI和Xbal酶切pIRES-B7-2質(zhì)粒和KS-IL18質(zhì)粒，補平粘端，再用 EcoR頂每切，得到pIRES-B7-2和IL18片斷，把IL18基因連接到pIRES-B7-2上，得到第二中間 質(zhì)粒PIRES-IL18-B7-2;
[0013] S3、用SacI酶切質(zhì)粒pIRES-IL18-B7-2,補平，電泳回收，得到IL18-B7-2大片斷，用 EcoRV酶切質(zhì)粒pcDNA3·l-Egr-Ι，去磷，把大片段IL18-B7-2連接到pcDNA3·l-Egr-Ι上，得到 雙基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2,即可。
[0014] 優(yōu)選的，所述mIL-18和mB7-2基因分別定向克隆至IRES前后插入位點，從而使mlL-18和mB7-2基因在同一載體上獲得良好相關(guān)表達(dá)。pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達(dá)重組質(zhì)粒 在聯(lián)合輻射抗腫瘤中的應(yīng)用，將所述重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染B16黑色素瘤細(xì)胞，經(jīng)0.1~6.OGy劑 量的X射線照射后體外激活Egr-Ι啟動子誘導(dǎo)mIL-18和B7-2表達(dá)。
[0015]優(yōu)選的，所述X射線照射劑量為0.5~5.OGy。
[0016] 優(yōu)選的，所述pEgr-IL18-B7.2雙基因能夠提高機體免疫活性，增強NK和CTL細(xì)胞毒 效應(yīng)，刺激T細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α，腫瘤局部B7-2的表達(dá)增強免疫細(xì)胞 對腫瘤細(xì)胞的識別殺傷能力。
[0017](三)有益效果
[0018]本發(fā)明提供了一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在聯(lián)合輻射抗 腫瘤中的應(yīng)用，本發(fā)明以多基因表達(dá)載體為基因?qū)胂到y(tǒng)，把有抗腫瘤作用的IL18基因及 共刺激分子B7-2基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，通過輻射誘導(dǎo)使之表達(dá)IL18及B7.2分子，增強腫瘤的 免疫原性，提高機體抗腫瘤的免疫功能;通過基因-放射治療不僅實現(xiàn)了放療、免疫及基因 治療的協(xié)同作用，而且達(dá)到了對基因表達(dá)的時空調(diào)控的目的；本發(fā)明可為惡性腫瘤患者提 供一個特異、靶向性的多基因聯(lián)合治療模式，并為臨床應(yīng)用奠定理論和實驗基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1為RT-PCR擴增小鼠mB7-2的cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的930bp 片段圖；
[0020] 圖2為質(zhì)粒pcDNA3.1-CMV-B7-2的酶切鑒定圖；
[0021]圖3為質(zhì)粒pcDNA3 · l-Egr-B7-2的鑒定圖；
[0022]圖 4 為質(zhì)粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2 的鑒定圖；
[0023]圖5為不同劑量X射線照射8h后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞表面B7.2蛋白表達(dá)變化 圖；
[0024]圖6為不同劑量X射線照射8h后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞上清中IL18表達(dá)變化圖；[0025]圖7為5Gy劑量X線照射C57/BLBC小鼠接種B16細(xì)胞后長出的黑色素瘤，基因放射治 療抑瘤作用圖；
[0026]圖8為C57/BLBC小鼠接種B16細(xì)胞后長出的黑色素瘤，基因放射治療后脾CTL細(xì)胞 毒性活性的變化圖；
[0027]圖9為C57/BLBC小鼠接種B16細(xì)胞后長出的黑色素瘤，基因放射治療后脾NK細(xì)胞毒 性活性的變化。
【具體實施方式】
[0028]為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例 及附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本 發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在 沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029]一、材料與方法[0030] 1、主要試劑及器材
[0031] 1.1試劑


[0039] 3、質(zhì)粒與菌種
[0040]雙基因共表達(dá)質(zhì)粒pIRESlneo購自BD公司，pMD18-T、pcDNA3.l( + )、pGL3-Egrl-EnhancerVector、pEgr_l由田梅博士惠贈，pBlueminusKS(-)_IL18由金光輝博士惠贈，感 受態(tài)大腸桿菌DH5a由本實驗室保存。
[0041] 4、細(xì)胞株
[0042] B16:惡性黑色素瘤細(xì)胞，由本實驗室保存，體外完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
[0043] YAC-1細(xì)胞:小鼠T淋巴瘤，由本實驗室保存，體外完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
[0044] L929細(xì)胞:小鼠成纖維細(xì)胞，本實驗室保存，體外完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
[0045] 5、實驗動物
[0046] C57BL/6J純系小鼠，一級，雌性，體重18±2g，健康，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物 部。
[0047] 6、照射條件
[0048]用國產(chǎn)X射線深部治療機進(jìn)行照射，電壓200kV，電流10mA，濾板為0.5mmCu和 1.〇11111^1^。低劑量照射時靶皮距243.7〇11，劑量率12.51116^1^11-1;高劑量照射時靶皮距 50cm，劑量率0.287Gy·min-1。
[0049] 7、病毒及其處理
[0050]濾泡性口炎病毒(VSV)由衛(wèi)生部生物制品所傳代保存。
[0051] VSV增殖：待L929細(xì)胞長成單層后加入400TCID50/mlVSV病毒液（TCID:tissue cultureinfectiondoses,病毒攻擊細(xì)胞發(fā)生50%病變的病毒稀釋液的倒數(shù)），設(shè)無病毒 對照組，待對照瓶中L929細(xì)胞生長良好，而病毒瓶中L929細(xì)胞幾乎全部發(fā)生病變時（36~ 48h)，將病變細(xì)胞置-20°C過夜，次日將其融解，用吸管猛烈吹打，離心3000rpm，20min，取上 清，測定TCID50后于-20°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0052] 8、分子生物學(xué)實驗方法
[0053] 8.1引物設(shè)計及合成
[0054] 根據(jù)小鼠B7-2的cDNA序列設(shè)計PCR引物（由TaKaRa公司合成）。
[0055] B7-2:有義鏈引物:5 ' -AACTTACGGAAGCACCCACG-3 '
[0056] 反義鏈引物：5 ' -CTCTCACTGCCTTCACTCTGC-3 '
[0057] 8.2脾細(xì)胞總RNA的提取及質(zhì)量鑒定
[0058]取健康6周齡的昆明小鼠脾臟，于RPMI1640培養(yǎng)液(無FBS)中用毛玻璃研磨洗2次， 取2X106脾細(xì)胞，用RNA提取試劑盒說明書提取小鼠脾細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA 純度及含量，A260與A280比值在1.8~2.0之間，基本無蛋白質(zhì)污染。RNA經(jīng)甲醛變性瓊脂糖 凝膠電泳后，28S與18S區(qū)帶清晰集中，28S與18S比值大于2，則表明RNA樣品未降解。
[0059] 8.3RT-PCR法釣取B7-2全長序列
[0060] 參照TaKaRaone-stepRNAPCRkit試劑盒說明書，以2yg總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，循環(huán)參數(shù)為：50°(315