111丨11，94°〇2111丨11，（94°〇3056(3,60°〇3056(3,72°(31111丨11)25個循環(huán)，72°〇 10min〇
[0061 ] 8.4RT-PCR產(chǎn)物鑒定及測序
[0062] 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，以DNAMarker比較特異片段長度，收取930bp大小的基 因片段，與PMD18-T載體連接，以ABI自動測序儀對克隆片段進(jìn)行雙向測序分析。根據(jù)RT-PCR法獲得的mIL-18cDNA序列，推導(dǎo)出其相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列，并通過BLAST方法與數(shù)據(jù)庫中的 序列進(jìn)行同源性比較。
[0063] 8.5重組表達(dá)載體構(gòu)建
[0064] 8.5.1轉(zhuǎn)化
[0065] 8.5.1.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣）
[0066] 以無菌接種環(huán)刮取凍存于-70°C冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉 素(Amp)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)16h左右;挑取單一菌落接種到100mlLB培養(yǎng)基中，37°C 150r/min振搖培養(yǎng)至0D600 = 0.4~0.6;在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個無菌、冰預(yù) 冷的聚丙稀離心管中（以下操作均需無菌），冰浴l〇min，培養(yǎng)物冷卻到0°C;4°C、4000r/min 離心lOmin，棄上清；以 10ml冰預(yù)冷的75mmol/LCaC12，10mmol/LtrisCl(pH6 · 5)溶液重懸 每管沉淀，冰浴lOmin; 4°C、4000r/min離心lOmin，收集菌體，經(jīng)2ml冰預(yù)冷的含15 % (v/v)甘 油的CaC12重新懸浮菌體，將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無菌微量離心管中，每管200μ1;標(biāo)明菌株， 體積和日期，置_70°C冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>[0067] 8.5.1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0068] 將適量質(zhì)粒(質(zhì)粒〈lug，連接產(chǎn)物<20μ1，DNA〈50ng)加入200μ1感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕 混勻，冰浴30min;42°C水浴熱沖擊90sec，冰浴冷卻2min;加到200μ1 37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基 中，37°C150r/min振搖培養(yǎng)50min，取培養(yǎng)液均勻涂于含Amp(50yg/ml)的LB瓊脂平板，37°C 培養(yǎng)14~16h后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。
[0069] 8.5.2質(zhì)粒擴(kuò)增
[0070] 8.5.2.1質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法）
[0071 ]挑取單個轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含Amp(50yg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37°C180r/min振搖 培養(yǎng)12~16h;將1.5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30sec，棄上清；以200μ1冰預(yù)冷 的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris.Cl，pH8·Ο;lOmmol/LEDTA，pH8 ·0)重懸沉淀；加 入200μ1新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1 %SDS)，顛倒數(shù)次混勻，加入200μ1用冰預(yù)冷的 溶液ΠI(3mo1KAc，5mo1冰乙酸），顛倒混勾，4°C1200r/min離心lOmin，取上清，分別用等量 飽和酚/氯仿/異戊醇/(25: 24:1 )，氯仿/異戊醇（24:1 )，各抽取一次;加2倍體積冷無水乙 醇，混合均勾，置-20°〇3〇111；[11，4°0120001'/111；[11離心10111；[11，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌抽 干。以20μ1 含終濃度20yl/mlRNA酶(無DNA酶）的TE(10mmol/LTris.Cl，pH8.0，下同）溶解 沉淀，并于37°C水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-20°C保存。
[0072] 8.5.2.2質(zhì)粒的大量制備
[0073] 將含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌接種于100ml含Amp(50yg/ml)LB培養(yǎng)液中，37°C250r/min 振搖培養(yǎng)16~18h;冰浴10min，4°C4000r/min離心10min，棄上清，沉淀用20ml預(yù)冷的特殊TE(STE, 10mmol/L,Tris.Cl,pH8.0；50mmol/LEDTA,pH8·0)洗滌一次，4000r/min離心lOmin， 棄上清；用4ml預(yù)冷的溶液I重懸沉淀，加8ml新配的溶液II充分混勾，冰浴lOmin后，加6ml預(yù) 冷的溶液ΠI終止反應(yīng)，冰浴lOmin，4°C7000r/min離心15min;取上清，加0.6倍體積的異丙 醇，室溫作用30min;4°C7000r/min離心15min，棄上清，以適量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等 體積的氯化鋰充分混勾，8000r/min離心15min，取上清;加2倍體積的100 %冷乙醇，-20°C沉 淀30min，4°C12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌并抽干；以適量TE (pH8·0)溶解沉淀后，加無DNA酶的RNA酶（10mg/ml)至終濃度20μg/ml，37°C作用30min;加等 體積 13%聚乙二醇溶液(PEG8000,2·5mol/NaCl)，4°C靜置過夜；4°C12000r/min離心10min， 棄上清;加400μ1TE(pH8.0)溶解沉淀，用等體積的酸，酸/氯仿/異戊醇(25:24:1)，氯仿/異 戊醇(24:1)各抽取一次，加0.1倍體積3MNaAc(pH5.2)，2倍體積100 %冷乙醇，混勻后-20°C 靜止3〇111；[11以上，4°(3120001'/1]1；[11離心101]1；[11，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌并抽干，溶于適 量TE(PH8.0)中，-20°C保存。
[0074] 8.5.2.3質(zhì)粒DNA的定量
[0075]以TE(pH8.0)為空白對照，紫外線可見分光光度計測定波長260nm和280nm下的核 酸溶液光密度(0D)值，0D260 = 1相當(dāng)于含質(zhì)粒大約50yg/ml，雙鏈DNA純品的0D260/0D280值 為1.8，如樣品0D260/0D280值明顯低于1.8，則可能有蛋白質(zhì)或酚污染，需要進(jìn)一步純化。 [0076] 8.5.3瓊脂糖凝膠電泳
[0077]用0 · 5XTBE電泳緩沖液（0 · 045mol/Ltris-硼酸，0 ·OOlmol/LEDTA)配1 % (w/v)瓊 脂糖凝膠溶液，微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解后，加EB(10mg/ml)至終濃度0.5μg/ml、混勻； 倒入封固好的膠模中，插入相應(yīng)的梳子，梳子距底板1 .〇_左右，待膠完全凝固，小心移去梳 子，將凝膠放入裝有0.5XTBE電泳緩沖液的電泳槽中，取適量DNA樣品在封口膜上與適量體 積加樣緩沖液(〇.25 %溴酚藍(lán)，0.25 %二甲苯青FF，40 %蔗糖)混勻，用微量加樣器將樣品加 到梳孔中，以5v/cm的電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至適當(dāng)位置，在長波紫外燈下觀察結(jié)果和拍 照。
[0078] 8.5.4限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
[0079] 8.5.4.1單酶切反應(yīng)
[0080] 將lyg質(zhì)粒與適量水混勻，加入2~3單位限制性內(nèi)切酶及2μ1相應(yīng)的10X限制性 內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)體系為20μ1，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應(yīng)溫度恒溫2~3h，瓊 脂糖凝膠電泳檢查。對大量質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)，相應(yīng)擴(kuò)大限制性內(nèi)切酶用量和反應(yīng)體系， 取少量反應(yīng)液電泳檢查，完全酶切后，-20°C保存，以備進(jìn)一步鑒定或回收片段之用。
[0081 ] 8.5.4.2雙酶切反應(yīng)
[0082] 選擇反應(yīng)活性等于或接近的同一緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，若溫度或緩沖系統(tǒng) 不同，則按先低溫后高溫，先低鹽后高鹽的順序進(jìn)行；或第一酶切反應(yīng)完成后，酚/仿抽提， 乙醇沉淀后，再進(jìn)行第二酶切反應(yīng)。
[0083] 8.5.5DNA片段回收
[0084]用瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA與其它DNA盡可能分開，用干凈的手術(shù)刀切下含所要 回收DNA的瓊脂塊，放入1.5ml離心管中；每100mg瓊脂糖凝膠中或100μΙ的DNA溶液中加入 400μ1BindingBuffer，置于60°C水浴中l(wèi)Omin，使凝膠徹底融化;將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到 套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8000rpm室溫離心lmin，取下UNIQ-10柱， 倒掉收集管中廢液，將UNIQ-10柱放回收集管中，加入500μ1Washsolution，10，000rpm室 溫離心15sec;將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5ml離心管中，在柱膜中央加30μ1Elution Buffer，室溫放置2min，10,000rpm離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段。
[0085] 8.5.6連接反應(yīng)
[0086] 8· 5·6· 1DNA片段的3'凹端補(bǔ)平
[0087] 在9μ1 反應(yīng)體系中，加入 1.7mmol/ldNTPlyl、0.1%BSAΙμL和T4DNAPolymerase BufferΙμL，先在70°C進(jìn)行5min保溫后，移入37°C恒溫箱中，加入ΙμLT4DNAPolymerase， 37°C反應(yīng)5min，劇烈震蕩使酶失活。
[0088] 8.5.6.2線性質(zhì)粒DNA末端去磷酸化
[0089] 在50μ1反應(yīng)體系中，分別加入完全消化的質(zhì)粒DNA約1~20pmol，5μ1 10 X CIAP緩 沖液和ΙμL CIAP，混勻后至37°C水浴30min;補(bǔ)加ΙμL CIAP，lyl CIAP緩沖液，8μ1水，55°C水 浴45min;加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度5mmol/L，終止反應(yīng);75°C水浴滅活lOmin;反應(yīng) 降至室溫后，用等量酚/仿抽提，乙醇沉淀，以1〇μ1 TE(pH8.0)溶解后，置_20°C保存。
[0090] 8.5.6.3粘端連接
[0091] 取0.5yg回收的載體DNA，加3~5倍摩爾量的外源DNA片段，3μ1 10XT4DNALigase Buffer，最后加入ΙμLT4DNALigase，反應(yīng)體系為30μ1，混勻并離心，16°C連接16h，取15μ1 連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
[0092] 8.5.6.4平端連接
[0093] 取Ο.?μL平末端去磷后的載體DNA，加入5~8倍量的平端目的DNA片段，3μ1 10XT4 DNALigaseBuffer，加入ΙμLΤ4DNALigase，反應(yīng)體系為30μ1，混勻并離心，16°C連接20 ~24h，取20μ1連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
[0094] 8.5.7重組子的鑒定
[0095] 8.5.7.1重組子的快速鑒定
[0096]用無菌牙簽挑取氨芐青霉素抗性菌落，涂抹于對應(yīng)編號的氨芐LB平板上，37°C16 ~20小時培養(yǎng)，再用無菌牙簽挑取相應(yīng)編號的菌苔到微量離心管中，每管加入30μ1 1X裂 解緩沖液（l〇〇mmol/LNA0H，5mmol/LEDTApH8.0,0.5%(W/V)SDS，0.025%溴酚藍(lán)，5%甘 油），在旋渦振蕩器上劇烈振蕩，室溫放置5分鐘，進(jìn)行DNA電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)指