、或份數(shù)按 重量計(jì)。
[0040] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0041] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0042] 實(shí)施例一、制備并鑒定新化合物A和B純品
[0043]a)將云樹用丙酮浸泡提取，每次浸泡使用的丙酮體積為云樹待提取的云樹藥材質(zhì) 量的5倍，每次浸泡一星期，共浸泡提取3次；合并丙酮浸泡提取液，減壓濃縮至無丙酮味； 采用二氯甲烷萃取濃縮液4次，減壓濃縮二氯甲烷萃取液得浸膏；
[0044]b)對所得浸膏采用硅膠柱層析分離：以二氯甲烷與甲醇按1:0-0:1的體積比形成 的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含有新化合物A或B的流份；
[0045]c)對所收集的流份進(jìn)行經(jīng)反相硅膠柱層析分離：以甲醇與水按15:35-90:10的體 積比形成的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含有新化合物A或B的流份；
[0046]d)采用HPLC純化新化合物A或B:采用waters2535Series，色譜柱XbridgePrep C180BD(3〇1ιιπιη(19Χ250πιπι，5μπι)，洗脫液是以乙腈與水按25:75的體積比形成的混合溶 液，且混合溶液中還含有0.lwt%三氟乙酸（TFA)，流速為16ml/min。收集保留時(shí)間為12. 1 分鐘的化合物A和保留時(shí)間為15. 6分鐘化合物B。
[0047] 化合物A的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)：
[0048] Cowaxanthone I (1)
[0049]HRESI-MS：393. 1326；
[0050]UV(MeOH):λmax(logε) 334 (3· 15)，58 (4· 45)nm;
[0051]IR(KBr):vmax3440,2973,2919,1647,1633,1587,1442,1288,1188,1122CHT1;
[0052]tf-NMR^OOMHzinCD30D)和 13C-NMR(150MHzinCD30D)數(shù)據(jù)見表 1。
[0053] 化合物B的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)：
[0054] Cowaxanthone J (2)
[0055]HRESI-MS:395. 1486
[0056]UV(MeOH):λmax(logε) 327 (3· 20)，253 (4· 61)nm;
[0057]IR(KBr):vmax3419,2919,1649,1608,1585,1284,1207,1159CHT1;
[0058]tf-NMR^OOMHzinCD30D)和C13-NMR(150MHzinDMS0-d6)數(shù)據(jù)見表 1。
[0059] 表1化合物A和化合物B的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)
[0060]
[0061] 實(shí)施例二、采用MTT法驗(yàn)證新化合物A和B的體外活性
[0062] 在細(xì)胞水平上檢測新化合物A或B對多種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。
[0063] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0064] 人腫瘤細(xì)胞株及其培養(yǎng)：Hela宮頸癌細(xì)胞、PANC-1人胰腺癌細(xì)胞株、A549人非小 細(xì)胞肺癌細(xì)胞株及HL-7702人肝細(xì)胞株等均購自中科院生化細(xì)胞研究所。細(xì)胞于含10%胎 牛血清（Gibco)的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。
[0065] 新化合物A和B按實(shí)施例1的方法制備并純化；其他試劑：MTT及DMS0等均為 Sigma公司產(chǎn)品。
[0066] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0067] 新化合物A和B對上述多種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性通過MTT法測得。具體步驟如 下：
[0068] 1.樣品制備：將新化合物A或B分別溶解月DMS0中，得到濃度為lmg/ml的溶液；
[0069] 2.細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)胎 盤藍(lán)染色排除法計(jì)或細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至1X1〇5細(xì)胞/ml。
[0070] 3.在平底96孔板中，每孔加入100微升細(xì)胞，每孔中細(xì)胞總數(shù)為IX104。于37°C、 5 %C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
[0071] 4.每孔加入5微升以細(xì)胞生長培養(yǎng)基稀釋的樣品，使反應(yīng)終濃度分別為0、0. 3、1、 3、10、30和100耶/1111。經(jīng)相應(yīng)量的0130加入不加藥的細(xì)胞中作為對照，不加藥物及0130 的含細(xì)胞孔作為背景。每點(diǎn)做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
[0072] 5.將加藥細(xì)胞在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫48小時(shí)。
[0073] 6.每孔中加入10ul5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3-4小時(shí)。
[0074] 7.將細(xì)胞板于lOOOrpm離心15分鐘，真空吸去培養(yǎng)液，加入150ulPBS洗滌后離 心并小心地吸去溶液。
[0075] 8.每孔加入150ulDMS0,置于搖床上以150rpm搖動15分鐘，使生成的甲簪晶體充 分溶解。測定492nm光吸收值。
[0076] 9.根據(jù)光吸收值計(jì)算新化合物A或B處理后細(xì)胞相對存活率。
[0077] 細(xì)胞相對存活率=(藥物處理組的光吸收值一背景吸收值）ADMS0處理組的光吸 收值一背景吸收值）
[0078] 表2新化合物對三種癌株的細(xì)胞毒性（IC5。（μM))
[0079]
[0080] 由表2可見：新化合物Α或Β對Hela宮頸癌細(xì)胞、PANC-1人胰腺癌細(xì)胞株以及 A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的生長均具有明顯抑制作用，強(qiáng)于陽性對照藥Etoposide(依 托泊甙），抗腫瘤活性顯著，可望作為活性成分用于制備抗腫瘤藥物制劑，具有藥用前景。
[0081] 實(shí)施例三、采用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證新化合物A和B影響細(xì)胞周期的活性
[0082] 取對數(shù)生長期HeLa宮頸癌細(xì)胞以1X106/mL接種于6孔板中，接種體積為2ml， 置37°C、5%C02孵箱中培養(yǎng)24h;分別設(shè)細(xì)胞對照組和3個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組（15、5、1.67μΜ); 培養(yǎng)24h后吸取培養(yǎng)液，加入胰酶消化，并用PBS洗一次；加入4°C70%乙醇固定30分鐘 后，用PBS潤洗并加入RNase(10μg/ml)，37°C孵育15分鐘；最后加入碘化丙陡（propidium iodide)并用FACSCalibur(BD，美國）檢測細(xì)胞周期。檢測結(jié)果見表3所示。
[0083] 表3新化合物A和B對He1a細(xì)胞細(xì)胞周期的影響
[0084]
[0085] 由表3可見：化合物A能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞S期阻滯，作用效果呈濃度依賴性提高。 化合物B能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞阻滯于G2/M期，抗腫瘤活性顯著。兩者均有望作為活性成分用 于制備抗腫瘤藥物制劑，具有藥用前景。
[0086] 本發(fā)明所涉及的多個(gè)方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神 之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對其進(jìn)行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請 所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物A，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥，其特征在于，所述化合物A可 從云樹中提取獲得且具有下列結(jié)構(gòu)式（I ):2. -種化合物B，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥，其特征在于，所述化合物B可 從云樹中提取獲得且具有下列結(jié)構(gòu)式（II ):3. -種如權(quán)利要求1或2所述的化合物的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： a) 首先將云樹用丙酮浸泡提取，然后減壓濃縮丙酮提取液至無丙酮味，再用二氯甲烷 萃取濃縮液，減壓濃縮二氯甲烷萃取液得浸膏； b) 對所得浸膏進(jìn)行硅膠柱層析分離：以二氯甲烷與甲醇按1:0~0:1的體積比形成的 混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含有目標(biāo)化合物的流份； c) 對所收集的流份進(jìn)行反相硅膠柱層析分離：以甲醇與水按65:35~90:10的體積比 形成的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含有目標(biāo)化合物的流份，濃縮，干燥。4. 一種防治腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含治療有效量的如權(quán)利要 求1或2所述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。5. 如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述腫瘤選自宮頸癌、胰腺癌和肺癌 中的一種或多種。6. -種防治腫瘤的保健品，其特征在于，所述保健品包含有效量的如權(quán)利要求1或2所 述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。7. 如權(quán)利要求6所述的保健品，其特征在于，所述腫瘤選自宮頸癌、胰腺癌和肺癌中的 一種或多種。8. 如權(quán)利要求1或2所述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥在制備腫瘤 細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述腫瘤細(xì)胞選自Hela宮頸癌細(xì)胞、PANC-1人胰腺癌細(xì) 胞株和A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的一種或多種。10. 如權(quán)利要求1或2所述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥在制備預(yù) 防或治療腫瘤的藥物或保健品中的應(yīng)用。11. 如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述腫瘤選自宮頸癌、胰腺癌和肺癌中的一種或多種。
【專利摘要】本發(fā)明涉及口山酮化合物及其制備方法、藥物組合物和用途，涉及天然化合物領(lǐng)域，特別是涉及兩種可從云樹中提取獲得的具有如下結(jié)構(gòu)式的新化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥及其制備方法、藥物組合物和用途：本發(fā)明的化合物可用于制備防治宮頸癌、胰腺癌和肺癌等多種腫瘤的藥物和保健品。
【IPC分類】A61K31/352, C07D493/04, A61P35/00, C07D311/86
【公開號】CN105440047
【申請?zhí)枴緾N201410280756
【發(fā)明人】徐宏喜, 夏正祥, 徐丹青, 勞遠(yuǎn)至, 譚紅勝, 付文衛(wèi)
【申請人】上海中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年6月20日