400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C 酶，和rhCBS Δ C代表未經(jīng)修飾的rhCBS Δ C酶。每一治療方式包括2組各5只小鼠，如實(shí)施例2 所述和圖1A所示（總共30只小鼠）將其在指定時(shí)間點(diǎn)放血。用放射活性測定法分析血漿的 CBS活性。
[0026]圖2是柱狀圖，顯示在重復(fù)SQ給予后達(dá)到的穩(wěn)定水平的CBS活性。注射聚乙二醇化 的、但不注射非聚乙二醇化的rhCBSAC，表現(xiàn)出CBS活性在體內(nèi)建立。GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，和rhCBS Δ C代表未經(jīng)修飾的rhCBS Δ C酶。在0、24、48小時(shí) (箭頭)給C57BL/6J小鼠注射5 mg/kg體重的非聚乙二醇化的rhCBS Δ C (n=5)或GL4-400MA rhCBS Δ C (n=5)并在指定時(shí)間點(diǎn)放血。用實(shí)施例lc所述的放射活性測定法分析血楽;的CBS 活性。
[0027]圖3闡明了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，表明單次注射聚乙二醇化的rhCBS Δ C在血漿中降低高半胱 氨酸和增加胱硫醚。圖3a是圖表，顯示在單次SQ給予經(jīng)指定類型的活化PEG修飾的rhCBS AC 之后，rhCBS AC的PEG修飾延長了CBS酶活性的系統(tǒng)性存在。該圖表顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將27 只C57BL/6J小鼠分為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n=3)。給各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)由SQ途徑注射5 mg/kg體重的用指定 PEG分子聚乙二醇化的rhCBS Δ C，或注射非聚乙二醇化的酶。ME020MA代表用ME020MA聚乙二 醇化的rhCBS Δ C酶，ME050GS代表用ME050GS聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，ME200GS代表用 ME200GS聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，200MA0B代表用200MA0B聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶， ME400MA代表用ME400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，GL2400MA代表用GL2400MA聚乙二醇化的 rhCBS Δ C酶，GL4400MA代表用GL4400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，GL2800MA代表用 GL2800MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，和rhCBS Δ C代表非聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶。在指定 時(shí)間點(diǎn)抽取血液樣品并用實(shí)施例lc所述的放射活性測定法測定CBS酶活性。數(shù)據(jù)表示為具 有標(biāo)準(zhǔn)偏差(STD)的直方圖，和散點(diǎn)圖。圖3b是柱狀圖，顯示在H0小鼠血漿中的Hey、Cth、Cys 和Met水平的天然晝夜變化。結(jié)果是在整個(gè)24小時(shí)周期中在指定時(shí)間點(diǎn)對6只HO小鼠（高胱 氛酸尿癥H0小鼠模型，描述于Maclean等人，2010，Mol. Genet. Metab. 101: 153-62)抽 血的平均值。在實(shí)施例le所述的各時(shí)間點(diǎn)，通過穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜檢測血漿氨 基酸水平。
[0028]圖3c是用ME-400MA (道1)、GL4-400MA (道2)或ME-200MA0B (道3)聚乙二醇化的 rhCBS AC的電泳分析結(jié)果的照片，與非聚乙二醇化的酶(道4)一起電泳分析，并用考馬斯藍(lán) 染色(M指示分子量標(biāo)準(zhǔn)）。每種聚乙二醇化的和非聚乙二醇化的rhCBS AC的比活(S.A.)示 于表中。
[0029]圖3d和3e是顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，其中在0時(shí)經(jīng)由SQ途徑給H0小鼠注射一次已 被指定PEG分子聚乙二醇化的rhCBS AC，并在0時(shí)（注射前）、注射后24、48和72小時(shí)放血。指 示各組(n=5-6)的血漿高半胱氨酸（d)和胱硫醚(e)水平。對圖3D和3E，ME-200MA0B代表用 ME-200MA0B聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，ME-400MA代表用ME-400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C 酶，和GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶。
[0030]圖4闡明了以下實(shí)驗(yàn)證據(jù)：中斷CBS治療讓氨基酸水平回到治療前水平，然后重新 開始重復(fù)注射聚乙二醇化的rhCBS Δ C顯著地影響高半胱氨酸和胱硫醚血漿水平，并恢復(fù)正 常半胱氨酸水平。在第0、1、2、3和4天，給6只H0小鼠注射用GL4-400MA PEG聚乙二醇化的 ^^5八(：，接著是10天清除期，然后在第14、15、16、17和18天(箭頭所示)再次注射。在以下 各天抽取血漿樣品（都在注射前）：第0、2、4、5、11、14、16、18、19、24和31天。為了比較，相同 注射方案在注射非聚乙二醇化的酶的5只H0小鼠中進(jìn)行。如實(shí)施例le所述測定血漿代謝物 水平。圖4a是顯示各H0小鼠的高半胱氨酸血漿濃度的結(jié)果的圖，和圖4b是顯示胱硫醚血漿 濃度的結(jié)果的圖。圖4c是顯示在本研究中經(jīng)治療的H0小鼠的血漿中的高半胱氨酸和胱硫醚 的平均濃度的圖。圖4d是顯示相比非聚乙二醇化的rhCBS AC (表示為0時(shí)的百分率），在本 研究中聚乙二醇化的rhCBS Δ C對血漿高半胱氨酸水平的效應(yīng)的圖。GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，和rhCBS Δ C代表未經(jīng)修飾的rhCBS Δ C酶。圖4e是顯示相比 非聚乙二醇化的rhCBS Δ C，在本研究中聚乙二醇化的rhCBS Δ C對血漿半胱氨酸水平的效應(yīng) 的圖。GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，和rhCBS Δ C代表未經(jīng)修飾的 rhCBS AC酶。
[0031 ]圖5顯示人截短CBS制劑(rhCBS Δ C)的聚集程度的變異性。圖5A是用rhCBS Δ c的不 同批次（112、13、7、27和28)的經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的4-15%非變性凝膠。注意rhCBS Δ C的四聚體 形式(T)和rhCBS AC的二聚體形式(D)、以及更高形式的聚集CBS之間的不同比例。Μ表示分 子量標(biāo)記。圖5B是非變性凝膠的膠內(nèi)（in-gel) CBS活性測定，表明對于圖5A中的rhCBS Δ C 批次112和28顯示的條帶，確實(shí)是CBS相關(guān)的。另外，注意rhCBS AC的四聚體形式(T)和rhCBS AC的二聚體形式（D)、以及更高形式的聚集CBS之間的不同比例。圖5C是SDS PAGE凝膠 (12%)，顯示用ME-200MA0B (+)聚乙二醇化的2個(gè)不同的rhCBS Δ C批次，表明在聚乙二醇化 后形成的兩種聚乙二醇化的種類(在聚乙二醇化的(+ )道)之間的不同比例，而當(dāng)不加 PEG試 劑時(shí)僅未經(jīng)修飾的rhCBS Δ C亞基存在(在非聚乙二醇化的(-)道）。
[0032]圖6顯示人C15S突變的CBS僅形成二聚體。圖6A是非變性凝膠，其顯示C15S突變的 CBS僅形成二聚體，與形成二聚體(D)和四聚體（T)和更高寡聚體形式的重組人截短CBS (rhCBS AC)相反。TCEP，一種還原劑，不影響C15S突變體的寡聚狀態(tài)。Μ表示分子量標(biāo)記。圖 6Β是顯示C15S突變的CBS的不同批次(51、60和73)的非變性凝膠，證明人(：155突變的085可 重現(xiàn)地僅形成二聚體，與不用PEG(-)和用ME-200MA0B聚乙二醇化的（+ )的rhCBSAC和重組 人雙重截短物(批次RC-2-76;具有rhCBS △ C殘基2-39額外缺失的構(gòu)建體)相反。C15S或雙重 截短構(gòu)建體的聚乙二醇化都產(chǎn)生一致的和可重現(xiàn)的條帶，與rhCBS AC相反，聚乙二醇化的 條帶之間具有類似比例。僅使用變性SDS PAGE，圖6C與圖6B相同。C15S產(chǎn)生可重現(xiàn)的聚乙二 醇化模式，其不同于重組的人截短CBS (rhCBS AC)。這也與圖5C相當(dāng)，顯示不可重現(xiàn)的 rhCBS Δ C的聚乙二醇化模式。
[0033] 圖7顯示rhCBS AC (圖7A)和C15S突變體（圖7B)的大小排阻色譜(SEC)分析。圖7提 供額外指示，顯示C15S突變體CBS僅以二聚體存在，因?yàn)閬碜?個(gè)不同純化批次，產(chǎn)生可重現(xiàn) 的單峰(圖7B)。注意圖7A中的rhCBSAC的6種不同模式和圖7B中的C15S CBS的單峰。
[0034]圖8顯示在2只H0小鼠中連續(xù)給予C15S突變體達(dá)20天，導(dǎo)致血漿高半胱氨酸的顯著 和持續(xù)減少。使用ALZET ?栗給予C15S突變酶，將該酶連續(xù)給予小鼠，代替重復(fù)皮下注射。 ALZET ?栗，型號1002，平均栗速0.21微升/小時(shí)(母液濃度為26.2mg/mL)，平均填充體積 106.6 ul。在指定時(shí)間點(diǎn)給小鼠放血，然后分離血衆(zhòng)，通過質(zhì)譜測定Hey。
[0035]圖9是顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，其中在零時(shí)給H0小鼠注射單劑量（7.5 mg/kg)的 rhCBSAC、C15S突變體(C15S)和雙重截短構(gòu)建體(雙重截短），其已用ME-200MA0B聚乙二醇 化。在零時(shí)（注射前）和注射后24、48和72小時(shí)給小鼠放血。指示各組(n=5-6)的血漿高半胱 氨酸水平。
[0036] 發(fā)明詳述 本文提供的是尤其適于藥物組合物的人胱硫醚合酶(CBS)的形式、以及用于治療高 胱氨酸尿癥的個(gè)體的方法，所述方法例如通過酶替代療法(ERT)。
[0037] 編碼人CBS的核酸序列和編碼它的氨基酸序列可得自GenBank檢索號L19501，并且 這些序列也公開于美國專利號5,523,225,其通過引用全部結(jié)合到本文中。CBS的編碼序列 在本文表示為SEQ ID N0: 1，是編碼SEQ ID N0: 2的核酸序列，SEQ ID N0: 2是具有551個(gè) 氨基酸殘基的全長人CBS的氨基酸序列。編碼CBS的基因組DNA的核酸序列也是通過序列數(shù) 據(jù)庫例如GenBank和科羅拉多-丹佛大學(xué)的Kraus實(shí)驗(yàn)室的網(wǎng)頁(University of Colorado-Denver webpage under Kraus Lab)公開可得的。
[0038]本文使用的胱硫醚β_合酶蛋白（CBS蛋白）、尤其是人CBS蛋白的分離的截短形式， 可包括但不限于，純化的截短CBS蛋白、經(jīng)化學(xué)切割和重組產(chǎn)生的截短CBS蛋白、和與其它蛋 白締合的分離的CBS蛋白。更具體地講，本發(fā)明的分離的蛋白是已從其天然環(huán)境中移出（即 已經(jīng)經(jīng)過人工操縱）的蛋白（包括多肽或肽)并且可包括例如純化的蛋白、部分純化的蛋白、 重組產(chǎn)生的蛋白、和合成產(chǎn)生的蛋白。因此，"分離的"并不反映蛋白被純化的程度。本發(fā)明 的分離的截短CBS蛋白可以是在細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞中經(jīng)重組而產(chǎn)生。另外，和舉例說明，"人 截短CBS蛋白"是指來自人（智人(Homo sapiens))的截短CBS蛋白（如本文所述)或指這樣的 CBS蛋白：其已通過其它方式，根據(jù)結(jié)構(gòu)(例如序列）的知識并且可能根據(jù)來自智人的天然存 在的CBS蛋白的功能而產(chǎn)生。換句話說，人截短CBS蛋白包括如本文詳述的有生物活性的截 短人CBS蛋白。
[0039] 本文使用的術(shù)語"變體"或"突變體"用于指不同于天然存在的蛋白或肽（8卩"原型" 或"野生型"蛋白）的蛋白或肽，即通過改變天然存在的蛋白或肽，但其保留天然存在的形式 的基本蛋白和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。這樣的改變包括但不限于:在一個(gè)、幾個(gè)或甚至若干個(gè)氨基酸側(cè)鏈 中的改變；在一個(gè)、幾個(gè)或若干氨基酸中的改變（例如，位置15的半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸； C15S);-個(gè)或幾個(gè)原子立體化學(xué)的改變;和/或較小的衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基 化、磷酸化、乙?；⑷舛罐Ⅴ；?、異戊稀化、棕櫚?；?palmi tat ion )、酰胺化和/或添加糖 基磷脂酰肌醇。與天然存在的蛋白或肽相比，"變體"或"突變體"可具有增強(qiáng)、減少、改變或 基本上類似的性質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供截短CBS蛋白，其具有天然存在的CBS 蛋白的C-末端缺失。
[0040] 本文使用的術(shù)語"同源物"或"直向同源物"是指具有共同祖先的蛋白或DNA序列， 并且可以是在不同物種中的基本相同的蛋白或DNA序列。同源和直向同源的蛋白和基因通 常分別具有相似的氨基酸和核苷酸序列，或高度序列相似性（例如，同源蛋白可具有50%、 60%、70%、80%、90%、95%或更高的氨基酸序列相似性）。
[0041] 本發(fā)明的測定CBS蛋白表達(dá)水平的方法包括但不限于:在分離介質(zhì)中的蛋白的考 馬斯藍(lán)或銀染，例如凝膠電泳、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)、其它基于免疫的測定法;基于蛋 白質(zhì)特性的測定法，包括但不限于，酶測定法、配體結(jié)合或與其它蛋白配偶體的相互作用。 結(jié)合測定法也是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，BIAcore儀器可用于測定兩種蛋白質(zhì)之間的復(fù)合 物的結(jié)合常數(shù)。當(dāng)緩沖液通過芯片時(shí)，可通過監(jiān)測折射率隨時(shí)間的變化來測定復(fù)合物的離 解常數(shù)。測定一種蛋白質(zhì)與另一種的結(jié)合的其它合適的測定法包括，例如，免疫測定法例如 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和放射免疫測定法(RIA)，或通過熒光、紫外吸收、圓二色性或 核磁共振(NMR)監(jiān)測蛋白質(zhì)的光譜學(xué)或光學(xué)性質(zhì)的變化而測定結(jié)合。
[0042] 在某些方面，CBS變體可包括N-末端缺失或修飾(例如，N-末端殘基2-39或1-70的 缺失）和C-末端缺失或修飾（例如，C-末端殘基383-551、397-551、414-551、442-551、489-551、497-551、524-551、534-551或544-551的缺失）的任何組合，其描述于本文或美國專利 號7，485，307和8，007，787，都通過引用結(jié)合到本文中。在另一實(shí)施方案中，額外修飾可以通 過修飾其它氨基酸殘基而實(shí)現(xiàn)，以提供與野生型CBS序列具有指定的％同一性。在具體的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的人CBS變體是截短的重組人CBS (rhCBSAC)同型二聚體酶，其中C-末端 調(diào)節(jié)區(qū)已被移除已被移除（SEQ ID N0: 3)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的人CBS變體是這樣 的rhCBSAC:其中氨基酸位置15的半胱氨酸已突變?yōu)榻z氨酸(C15S) (SEQ ID N0: 13)。 [0043]在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本文所述的任何CBS變體在N-端具有不超過一個(gè)或 兩個(gè)非CBS氨基酸殘基（即所述變體在N-端包含不超過一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基，該殘基不是 天然存在的人胱硫醚合酶氨基