液，進(jìn)行封板
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，向包被細(xì)胞周期因子Y的固相載體中加入2-10%胎牛血清 封閉液，4°C封閉過夜后洗板，得到封閉后的固相載體。由此，通過胎牛血清對固相載體進(jìn)行 封板，避免其它蛋白與固相載體結(jié)合，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
[0056] S1000加入細(xì)胞周期因子Y和待檢測的血清進(jìn)行梯度稀釋
[0057] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將細(xì)胞周期因子Y和待檢測的樣品進(jìn)行梯度稀釋，并加入到 所述封閉后的固相載體中，孵育后洗板。由此，以細(xì)胞周期因子Y作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過固相載體 上單克隆抗體捕獲待測血清中的細(xì)胞周期因子Y，從而對其進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí) 施例，該樣品為血清或血漿
[0058] S1100加入識(shí)別細(xì)胞周期因子Y的多克隆抗體
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，向S1000得到的固相載體中加入識(shí)別細(xì)胞周期因子Y的多克 隆抗體，孵育后洗板。利用該多克隆抗體作為檢測抗體，與結(jié)合到固相載體上的細(xì)胞周期因 子Y結(jié)合，該檢測抗體與細(xì)胞周期因子Y的親和性極高，充分識(shí)別與固相載體上的單克隆抗 體相結(jié)合的細(xì)胞周期因子Y，不僅進(jìn)一步排除了檢測過程中的假陽性結(jié)果，而且檢測的靈敏 度更高，同時(shí)，辣根酶標(biāo)記抗體與該多克隆抗體結(jié)合，便于催化后續(xù)顯色反應(yīng)，對細(xì)胞周期 因子Y進(jìn)行檢測。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述多克隆抗體為兔源性細(xì)胞周期因子Y多克隆抗體。 由此，采用兔源性多克隆抗體可以避免與固相載體上的鼠源性單克隆抗體同源，進(jìn)而，防止 辣根酶標(biāo)記抗體在檢測時(shí)非特異性地識(shí)別固相載體上的鼠源性單克隆抗體，導(dǎo)致雙抗夾心 反應(yīng)鏈不成立，造成檢測失敗。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該多克隆抗體的濃度為100_300μ g/ml〇
[0061 ] S1200加入辣根酶標(biāo)記抗體
[0062]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，向S1100得到的固相載體中加入辣根酶標(biāo)記抗體，孵育后洗 板。由此，辣根酶標(biāo)記抗體與該多克隆抗體結(jié)合，便于催化后續(xù)顯色反應(yīng)，對細(xì)胞周期因子Y 進(jìn)行檢測。
[0063] S1300加入底物顯色液
[0064]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，向S1200得到的固相載體中加入底物顯色液。由此，底物顯 色液在結(jié)合到多克隆抗體上的辣根酶標(biāo)記抗體催化下，進(jìn)行顯色反應(yīng)。
[0065] S1400加入終止液，終止反應(yīng)，檢測0D450的值
[0066]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，向S1300得到的固相載體中加入終止液，終止反應(yīng)，檢測 0D450的值，通過分析0D450值的大小，判斷人細(xì)胞周期因子Y的濃度。由此，固相載體各孔顏 色的深淺與樣品中細(xì)胞周期因子Υ的含量呈正相關(guān)，通過檢測固相載體中的溶液的0D450 值，可以有效、準(zhǔn)確和快捷的判斷血清中細(xì)胞周期因子Υ抗體濃度。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該方法可以利用前述的試劑盒進(jìn)行。由此，操作更簡 便，結(jié)果更準(zhǔn)確。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，采用雙抗夾心法，以特異性單克隆抗體作為捕獲細(xì)胞 周期因子Υ的抗體，保證了檢測結(jié)果的特異性，最大程度避免了假陽性;隨后以特異性多抗 作為檢測抗體，該檢測抗體與細(xì)胞周期因子Υ的親和性極高，充分識(shí)別與固相載體上的單克 隆抗體相結(jié)合的細(xì)胞周期因子Υ，不僅進(jìn)一步排除了檢測過程中的假陽性結(jié)果，而且檢測的 靈敏度更高，再加入辣根酶標(biāo)記抗體，形成一個(gè)4組分的夾心形狀的結(jié)合物，最后加入底物 顯色液，將以上得到的正確信號(hào)有效放大，對比同步平行進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步 排除實(shí)驗(yàn)中的試劑或操作誤差，最終得到可信賴的結(jié)論。由此，利用該方法可以簡便、準(zhǔn)確、 靈敏和高效的檢測細(xì)胞周期因子Υ，尤其是人血清和血漿中的細(xì)胞周期因子Υ。
[0069] 下面參考具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明 性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0070] 實(shí)施例1
[0071] 以多肽（多肽的氨基酸序列：ENLHPLSKSEVPPDYDKHNPEQKQIYRFVR，SEQIDΝ0:1)為 抗原免疫小鼠，獲取分泌特異性單抗的淋巴Β細(xì)胞，后者與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合得雜交瘤細(xì) 胞，將雜交瘤細(xì)胞直接接種至小鼠腹腔獲取單抗。制備鼠源性細(xì)胞周期因子Υ單克隆抗體， 具體步驟如下：
[0072] (1)選用Balb/c小鼠，將采用MBS連接法將KLH載體蛋白與該多肽進(jìn)行連接，得到 KLH-多肽連接體(KLH載體蛋白-ENLHPLSKSEVProYDKHNPEQKQIYRFVR)溶液，該溶液的濃度為 3mg/ml〇
[0073] (2) 0.3mlKLH_多肽連接體溶液與等量的完全弗氏佐劑混合，乳化，得到免疫乳劑。
[0074] (3)將免疫乳劑皮下多點(diǎn)注射Balb/c小鼠5只（18_22g，雌性，購買于維通利華實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心)進(jìn)行初次免疫。
[0075] (4)三周后，采用相同劑量免疫乳劑腹腔注射，加強(qiáng)免疫，其中，該加強(qiáng)免疫的免疫 乳劑為〇.3mlKLH-多肽連接體溶液與等量的不完全弗氏佐劑混合乳化得到的，10天后，眼眶 取血，分別測定每只小鼠的抗體效價(jià)，選取抗體滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。
[0076] (5)無菌的條件下獲取抗體滴度高的Balb/c小鼠脾細(xì)胞，用PEG融合處于對數(shù)生長 期的骨髓瘤細(xì)胞和Balb/c小鼠脾細(xì)胞，制備雜交瘤細(xì)胞。
[0077] (6)雜交瘤細(xì)胞以HAT選擇性培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)有限稀釋后選出高抗體分泌孔， 將孔內(nèi)細(xì)胞克隆，進(jìn)行篩選和鑒定，然后細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0078] (7)將Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷進(jìn)行預(yù)處理。
[0079] (8)2周后，將預(yù)處理后的小鼠腹腔內(nèi)接種lml對數(shù)生長的1.0X107個(gè)細(xì)胞/ml雜交 瘤細(xì)胞。2-4周后，小鼠腹部膨大，收集腹水。
[0080] (9)采用蛋白G微珠層析柱將腹水進(jìn)行親和層析純化獲得細(xì)胞周期因子Y鼠源性單 克隆抗體。
[0081 ] 實(shí)施例2
[0082]利用PCR法對編碼細(xì)胞周期因子Y的基因進(jìn)行擴(kuò)增，具體如下：
[0083] (1)樣本DNA的獲取
[0084]以Α549肺腺癌細(xì)胞為原料收集樣本DNA，具體方法如下：
[0085]Α、收集Α549肺腺癌細(xì)胞1*106個(gè)。
[0086]Β、利用TRIzolRNA抽提試劑提取Α549肺腺癌細(xì)胞的RNA樣本。
[0087]C、利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Superscript?IIICellsDirect?cDNASynthesisKit (Invitrogen?)對RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得A549肺腺癌細(xì)胞的cDNA模板。
[0088] (2)PCR反應(yīng)
[0089] 上游引物：5'-TAACCCATGGGGAACACTACCTCGTGC-3'（SEQIDN0:2)
[0090] 下游引物：5'-AATACTCGAGCTAAGAGATGATGGC-3'（SEQIDN0:3)
[0091 ]PCR反應(yīng)體系：
[0092] cDNA模板 2μ1
[0093] 2UAUpfuDNA聚合酶ΙμL
[0094] lOmMdNTPΙμL
[0095] lOmM上、下游引物各ΙμL，
[0096] 10XPCRbuffer5μ1
[0097] 補(bǔ)水至 50μ1。
[0098] PCR條件：
[0101] 72°C延伸lOmin
[0102] 4°C終止反應(yīng)。
[0103] (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
[0104] 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司，產(chǎn)品編號(hào)： DP209)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟詳見試劑盒說明書，得到純化的CCNY的編碼基因。
[0105] 實(shí)施例3
[0106] 利用實(shí)施例2獲得擴(kuò)增后的細(xì)胞周期因子Y的編碼基因，制備His-CCNY重組蛋白的 操作步驟如下：
[0107] (1)將實(shí)施例1獲得擴(kuò)增后的CCNY的編碼基因，經(jīng)Ncol/Xhol酶切體系雙酶切后連 入質(zhì)粒pET30a( + )。
[0108] (2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，振搖培養(yǎng)，當(dāng)大腸桿菌培養(yǎng)液的 0D600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.4mM/L，誘導(dǎo)表達(dá)3h，收集菌體，超聲破碎，收集上清。 [0109] (3)將收集的上清按照GE公司HISTrap純化試劑盒操作說明進(jìn)行純化，純化條件 為:2ml親和層析柱，親和層析柱平衡液12ml，上樣速度為0.5ml/min，親和層析柱50mM/L咪 唑洗滌液20ml，上樣速度為0.5ml/min，親和層析柱200mM/L咪唑洗脫液10ml，上樣速度為 0.5ml/min。根據(jù)0D28Q分光光度值，將收集200mM/L咪唑洗脫液的峰值取50μ1進(jìn)行SDS-PAGE 膠進(jìn)行純度的驗(yàn)證。
[0110] (4)將200mM/L咪唑洗脫液0D28Q的峰值裝入透析袋中，pH7.4的ros液中透析過夜， 期間換液3次。
[011