1] (5)將透析袋中的液體分裝入冷凍干燥管中，每管中的總蛋白量為0.lyg，冷凍成 粉末，放入-80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0112] (6)SDS-PAGE膠蛋白純度驗(yàn)證的方法如下:將收集200mM/L咪唑洗脫液的峰值取40 μL，加入1〇μ1的5X上樣緩沖液，100°C加熱10min，12000轉(zhuǎn)/min離心，取上清15μ1上樣，12% SDS-PAGE膠，80伏恒壓lOmin，120伏恒壓60min，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色，膠圖分析，結(jié)果顯 不：蛋白純度2 95 %。
[0113] 實(shí)施例4
[0114] 利用實(shí)施例1獲得的CCNY鼠源性單克隆抗體包被酶標(biāo)板，得到固化CCNY單克隆抗 體的酶標(biāo)板，具體步驟如下：
[0115] (1)取實(shí)施例1獲得的CCNY鼠源性單克隆抗體，用包被緩沖液稀釋成lyg/ml，得到
[0116] 包被液，4°C保存，備用。
[0117] (2)將包被液加入至96孔平底聚苯乙烯試劑板，每孔加100yl，4°C過夜。
[0118] (3)洗板三次，拍干板中液體，每孔加入200μ1 5 %胎牛血清封閉液，4°C封閉過夜。
[0119] (4)洗板三次，拍干板中液體，得到包被CCNY的酶標(biāo)板，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0120] 實(shí)施例5
[0121] 本實(shí)施例的試劑盒為細(xì)胞周期因子Y雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒， 該試劑盒包括:實(shí)施例4得到的固化細(xì)胞周期因子Y單克隆抗體的酶標(biāo)板1塊、細(xì)胞周期因子 Y標(biāo)準(zhǔn)品2瓶，檢測抗體1XΙΟμΙ，辣根過氧化物酶標(biāo)抗體1XΙΟμΙ/管，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1X 20ml，濃洗滌緩沖液(20X) 1X20ml，抗體稀釋液1X20ml，底物顯色液A1X5ml，底物顯色 液B1X5ml，終止液1X6ml。具體說明如下：
[0122] (1)細(xì)胞周期因子Y標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）
[0123] 實(shí)施例3得到的細(xì)胞周期因子Y，2ng，每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1ml，蓋好后室 溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒以助溶解，濃度為2ng/ml。
[0124] (2)檢測抗體
[0125] 兔源性細(xì)胞周期因子Y多克隆抗體(購自Sigma，貨號(hào):HPA036290)，體積1Ομ1，濃度 為200yg/ml。
[0126] (3)辣根過氧化物酶標(biāo)抗體
[0127] 山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)抗體，體積ΙΟμΙ，濃度為0.2μg/ml。使用時(shí)，用辣根過 氧化物酶標(biāo)抗體稀釋液將1〇μ1抗體稀釋成20ml，進(jìn)行2000倍稀釋。
[0128] (4)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
[0129] 組成為：每20ml含有NaCl0.1g，KCl0.0058，1012?040.0058，恥2冊(cè)040.0368，余量 為去離子水。
[0130] (5)辣根過氧化物酶標(biāo)抗體稀釋液
[0131] 組成為：每20ml含有NaCl0.1g，KCl0.0058，1012?040.0058，恥2冊(cè)040.0368，余量 為去離子水。
[0132] (6)洗滌濃縮緩沖液
[0133] 組成為：每20ml含有NaCl2g，KCl0.1g，KH2P040.1g，Na2HP040.72gdj^ja-20400y 1，余量為去離子水。使用時(shí)，用380ml蒸餾水或去離子水將20ml濃洗滌液稀釋至400ml，進(jìn)行 20倍稀釋。
[0134] (7)底物顯色液A
[0135] 組成為:每5ml含有醋酸鈉0.136g，梓檬酸0.016g，體積百分濃度為30 %的Η2023μ1，余量為去離子水，避光保存。
[0136] (8)底物顯色液Β
[0137] 組成為:每5ml含有EDTA-Na0.002g，檸檬酸0.0095g，丙三醇0.5ml，四甲基聯(lián)苯胺 0.002g，余量為去離子水，避光保存。
[0138] (9)終止液
[0139] 組成為：l-3mol/LH2S〇4 溶液。
[0140] (10)酶標(biāo)板
[0141] 實(shí)施例4制備得到的細(xì)胞周期因子Y單克隆抗體包被的酶標(biāo)板。
[0142] 實(shí)施例6
[0143] 檢測實(shí)施例5的試劑盒的檢測范圍和靈敏度，具體如下：
[0144] (1)細(xì)胞周期因子Y標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比稀釋10次，濃度從2ng/ml至 0·0039ng/ml，。
[0145] (2)加樣：10個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入酶標(biāo)板，100μΙ/孔，另設(shè)空白孔，加入標(biāo)準(zhǔn)品 稀釋液，每個(gè)樣品3復(fù)孔，37°C，孵育2h。
[0146] (3)棄去步驟(2)中酶標(biāo)板的液體，洗滌緩沖液300μ1/孔，洗板三次，拍干。
[0147] (4)向步驟(3)得到的酶標(biāo)板中，每孔加入檢測抗體100yl，37°C，lh。
[0148] (5)棄去步驟(4)得到的酶標(biāo)板中的液體，洗滌緩沖液300μ1/孔，洗板三次，拍干。
[0149] (6)向步驟(5)得到的酶標(biāo)板中，每孔加入酶標(biāo)抗體100μ1，37°C，1h。
[0150] (7)棄去步驟(4)得到的酶標(biāo)板中的液體，洗滌緩沖液300μ1/孔，洗板五次，拍干。 [0151 ] (8)底物顯色液Α和Β等體積充分混合，向步驟(5)得到的酶標(biāo)板中，依次加入混合 液100μΙ/孔，37°C避光顯色 15-30min。
[0152] (9)向步驟（8)得到的酶標(biāo)板中，依次加入終止液50μ1，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在 450nm波長讀數(shù)(0D值），具體結(jié)果如下，結(jié)果表明，試劑盒的檢測靈敏度為0.0078ng/ml，檢 測范圍為 0·〇〇78ng/ml_2ng/ml。
[0153]
[0154] 實(shí)施例7
[0155] 測定實(shí)施例5的試劑盒的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。
[0156] (1)批內(nèi)變異系數(shù)：
[0157] 將3個(gè)濃度分別為0.25ng/ml的細(xì)胞周期因子Y標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照實(shí)施例6的方法， 在一塊酶標(biāo)板上分別測定25次，具體結(jié)果如下：
[0158]
[0159] 批內(nèi)變異系數(shù)計(jì)算公式:CV=(批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）X100%
[0160] 結(jié)果：按上述批內(nèi)變異系數(shù)計(jì)算公式，經(jīng)計(jì)算，該試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)CV= 0.01637/0.2601*100% =6.28% ;CV〈10%，符合規(guī)定。
[0161] (2)批間變異系數(shù)：
[0162] 將濃度為0.25ng/ml，的細(xì)胞周期因子Y標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照實(shí)施例6的方法，由4名工 作人員共測定25次，具體結(jié)果如下：
[0163]
[0164] 批間變異系數(shù)計(jì)算方法:CV=(批間標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）X100%
[0165] 結(jié)果：按上述批間變異系數(shù)計(jì)算公式，經(jīng)計(jì)算，批間變異系數(shù)CV= 0.0212/0.2731 X100%=7.77%;CV〈10%，符合規(guī)定。
[0166] 通過測定血清細(xì)胞周期因子Y蛋白檢測試劑盒批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于 10%，表明該試劑盒具有很好的穩(wěn)定性。
[0167] 實(shí)施例8
[0168] 實(shí)施例5的試劑盒可用于測定血清、血漿中細(xì)胞周期因子Y蛋白的含量，具體如下：
[0169] 1、標(biāo)本的采集及保存：
[0170] (1)血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4°C過夜，然后離心 1000gX20分鐘，取上清分裝，將分裝好的上清置于_80°C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
[0171] (2)血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于4 °C離心1000gX15分鐘，取上清分裝，將分裝好的上于-80°C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
[0172] 2、試劑準(zhǔn)備：
[0173](1)使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫（18_25°C)，試劑不能直接在37°C溶解。
[0174] (2)標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液ΙΟΟΟμΙ，蓋好后室溫靜置大約 10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為2ng/ml。然后準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的ΕΡ管， 每個(gè)EP管中加入500yL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，依次倍比稀釋成lng/ml;0.5ng/ml;0.25ng/ml; Ο· 125ng/ml;Ο· 0625ng/ml;Ο· 03125ng/ml;Ο· 015625ng/ml，Ο· 0078ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 (Ong/ml)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0175] (3)辣根過氧化物酶標(biāo)抗體：用辣根過氧化物酶標(biāo)抗體稀釋液將ΙΟμΙ辣根過氧化 物酶標(biāo)抗體稀釋成20ml，進(jìn)行2000倍稀釋。
[0176](4)濃縮洗滌緩沖液:用380ml蒸餾水或去離子水將20ml濃洗滌液稀釋至400ml，進(jìn) 行20倍稀釋。
[0177] 3、操作步驟：
[0178] (1)加樣:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)