鴨支原體培養(yǎng)基及鴨支原體的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細菌培養(yǎng)基及分離純化的方法，具體涉及鴨支原體培養(yǎng)基及鴨支原體的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]鴨支原體(Mycoplasmaanatis)主要引起鴨的傳染性竇炎，臨床上易感染雛鴨，導致眶下竇、鼻腔、氣管及氣囊的炎癥，其中眶下竇腫脹最為典型。當鴨支原體與其他病原(如流感病毒、大腸細菌)混合感染時，可引起鴨呼吸困難、軟腳、腹瀉、共濟失調(diào)、斜頸、轉圈或倒退運動等一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴重影響鴨的生長和發(fā)育；組織學病變表現(xiàn)為淋巴細胞性腦膜炎、纖維蛋白滲出性的氣囊炎、間質性肺炎和淋巴濾泡性氣管炎(Stipkovits，
2012)o
[0003]1964年Robert首次報道從患有竇炎的小鴨中分離出鴨支原體，之后西班牙、美國等國家相繼分離到鴨支原體，karpas、Amin等從北京鴨、短頸小野鴨和斑背淺鴨中分離出鴨支原體(Ivanics et al，1988;Poveda et al，1990;Goldberg et al，1995)。我國是世界上主要的鴨養(yǎng)殖基地，鴨肉產(chǎn)量占全球總量的66%;國內(nèi)學者于1989年和1991年就證實了鴨支原體在我國的存在，而近兩年國內(nèi)有關鴨支原體合并病毒、細菌感染的病例屢見不鮮，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大危害和經(jīng)濟損失，表明鴨支原體感染在我國持續(xù)時間已經(jīng)很久。
[0004]鴨支原體是一類特殊的微生物，無細胞壁，由于其基因組較小，造成基因組中編碼氨基酸和輔助因子合成的基因就少，導致支原體生物合成和代謝的能力相當有限；由于支原體屬于氨基酸、脂類和某些輔助因子營養(yǎng)缺陷型，很難對環(huán)境變化做出調(diào)整，僅在特定的環(huán)境下生存，因此鴨支原體對體外培養(yǎng)基的選擇相當苛刻，需要從中攝取脂肪酸、膽固醇、核酸前體和能量來源等營養(yǎng)成分促進自身繁殖。鴨支原體(Mycoplasma anatis)不同于其他禽類支原體，如雞毒支原體(Mycoplasma gal lispeticum)、滑液支原體(Mycoplasmasymoviae)、泄殖腔支原體(Mycoplasma cloaclae)、萊氏無膽甾支原體(Acolaplasmalaidlawii)等感染多種宿主，鴨支原體只寄生于鴨體內(nèi)。關于鴨支原體的診斷，主要為聚合酶鏈反應(PCR)和直接免疫熒光實驗(FA)，二者均涉及支原體純培養(yǎng)物即單個菌落的分離和培養(yǎng);而目前分離鴨支原體使用的人工培養(yǎng)基一般均由Frey或PPL0培養(yǎng)基改良而來，仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等問題，易產(chǎn)生漏診；因此，本領域亟需高效穩(wěn)定、快速分離診斷鴨支原體的培養(yǎng)基以及分離純化鴨支原體的方法，進而開展鴨支原體感染的治療與防控研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了鴨支原體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能夠用來分離純化鴨支原體，活菌滴度高，繁殖能力強;本發(fā)明還提供應用該培養(yǎng)基分離純化鴨支原體的方法。
[0006]本發(fā)明為解決以上技術問題所采用的方案為:
鴨支原體培養(yǎng)基，包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，所述液體培養(yǎng)基由以下組分組成:去離子水，10%的醋酸鉈溶液，PPLO肉湯，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚紅，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基，滅活的馬血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸鹽酸鹽和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述固體培養(yǎng)基由以下組分組成:去離子水，10%的醋酸鉈溶液，PPLO肉湯，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，瓊脂粉，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基，滅活的馬血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸鹽酸鹽和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
[0007]作為優(yōu)選，所述液體培養(yǎng)基由以下組分組成:10%的醋酸鉈溶液4.5-6mL/L，PPLO肉湯3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8_10g/L，1%的酚紅2_3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基450-500mL/L，滅活的馬血清150-180mL/L，酵母浸出液45-55mL/L，青霉素200-300萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1-0.2g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量為去尚子水。
[0008]最優(yōu)選地，所述液體培養(yǎng)基由以下組分組成:10%的醋酸鉈溶液4.8mL/L，PPL0肉湯3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，1%的酚紅2mL/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培養(yǎng)基450mL/L，滅活的馬血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量為去離子水。
[0009]作為優(yōu)選，所述固體培養(yǎng)基由以下組分組成:10%的醋酸鉈溶液4.5-6mL/L，PPLO肉湯3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8_10g/L，瓊脂粉10_12g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基450-500 mL/L，滅活的馬血清150_180mL/L，酵母浸出液45_55mL/L，青霉素200-300萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1-0.2g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-
0.2g/L，余量為去咼子水。
[0010]最優(yōu)選地，所述固體培養(yǎng)基由以下組分組成:10%的醋酸鉈溶液4.8mL/L，PPLO肉湯3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，瓊脂粉12g/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培養(yǎng)基450mL/L，滅活的馬血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量為去離子水。
[0011]作為優(yōu)選，所述酵母浸出液的制備方法為:將酵母溶于5倍去離子水中，在30°C下磁力攪拌1小時；10-15分鐘內(nèi)逐漸增加溫度到40°C ；之后每分鐘增加5°C至沸點，煮沸3-5分鐘，冷卻至室溫，離心，取上清，依次經(jīng)0.8 μηι、0.45 μηι、0.22 μπι的濾器過濾后收集濾液即得。
[0012]采用上述方法制備得到的酵母浸出液具備以下優(yōu)點:不斷攪拌可使酵母的溶解性增加，浸出液色澤為淡黃色至黃色;緩慢升高溫度可減少浸出液營養(yǎng)成份的破壞;整個制備過程的總時間控制在2小時左右，減少了污染雜菌的概率。
[0013]作為優(yōu)選，除添加瓊脂粉，去掉酚紅指示劑外，所述固體培養(yǎng)基其余組分和各組分含量均與液體培養(yǎng)基相同。通常情況之下，固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基成分應該保持一致的，這樣能夠確保支原體生長狀態(tài)的穩(wěn)定；另外在大批量配置液體及固體培養(yǎng)基時可同時進行，節(jié)省人力和時間。
[0014]本發(fā)明還提供上述培養(yǎng)基的制備方法，所述液體培養(yǎng)基的制備方法為:將配方量的去離子水，10%的醋酸鉈溶液，PPL0肉湯，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚紅充分混勻，調(diào)pH值為7.8，121°C高壓滅菌15分鐘，冷卻至50-55°C，加入配方量的無菌的CMRL-1066培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺)，滅活的馬血清，酵母浸出液，無菌的青霉素水溶液，無菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液以及無菌的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，添加時無先后順序，最后微調(diào)pH值至 7.7-7.8。
[0015]作為優(yōu)選，所述固體培養(yǎng)基的制備方法為:將配方量的去離子水，10%的醋酸鉈溶液，PPL0肉湯，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，瓊脂粉充分混勻，調(diào)pH值為7.8,121°C高壓滅菌15分鐘，放入50-55°C的水浴鍋中冷卻，加入配方量的無菌的CMRL-1066培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺)，滅活的馬血清，酵母浸出液，無菌的青霉素水溶液，無菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液以及無菌的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，添加時無先后順序，混勻后倒平板，得固體培養(yǎng)基。
[0016]本發(fā)明的第三個目的是提供鴨支原體分離純化的方法，包括以下步驟:
1.用無菌棉簽在鴨的鼻后孔、氣管、泄殖腔或氣囊采樣、或挑取大約0.lmL的卵黃液(含部分卵黃膜)、或無菌條件下剪切小塊病樣組織接種到4.5mL的液體培養(yǎng)基中(棉簽需棄掉)，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后，進行第一代盲傳，無論液體培養(yǎng)基顏色是否改變，將上述液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基進行菌落生長;若此時，上述液體培養(yǎng)基pH下降，顏色由紅色變?yōu)辄S色，可按1:10的比例轉接到新的液體培養(yǎng)基中傳代增殖;若未發(fā)生pH值下降，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待顏色變黃立即轉接新的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。
[0017]2.上述固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7天，低倍鏡下觀察菌落的生長情況，用接種環(huán)無菌刮取平板上的菌落接種到新的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長，再將變黃的培養(yǎng)物接種到固體培養(yǎng)基上;重復該步驟，確保分離到支原體特征菌落。
[0018]步驟1和2表明，由于初步分離支原體時，病料本身和其他雜菌污染可能會抑制鴨支原體的生長，影響支原體的分離，因此，在首次接種液體培養(yǎng)基24小時后，無論液體培養(yǎng)基是否發(fā)生顏色改變，需在固體培養(yǎng)基中進行盲傳；同時，根據(jù)液體培養(yǎng)基顏色的變化，考慮是否轉接新液體培養(yǎng)基進行增殖。若24小時內(nèi)液體培養(yǎng)基未發(fā)生顏色的改變，需繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，待pH下降、液體變黃時轉接新的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基進行增殖和分離。由于病料的來源、類型不同，支原體在分離初期生長的速度也不盡相同，因此需多次重復步驟2，確保分離到支原體特征性菌落。