>[0019]3.用0.45μπι-0.22μπι的濾器過濾上述培養(yǎng)支原體特征菌落生長變黃的液體培養(yǎng)物，然后取200yL過濾的培養(yǎng)物(原液)加到1.8 mL液體培養(yǎng)基中做連續(xù)10倍稀釋(10—工_10一7);將平皿劃為8等分，依次取5yL原液和不同濃度的稀釋液分別涂布到固體培養(yǎng)基上，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，用低倍顯微鏡觀察，可見分布均勻，邊緣整齊，中間較厚，周邊透明的“油煎蛋”樣圓形菌落。
[0020]4.在顯微鏡下選取單個的特征菌落，并在平板底部做好標(biāo)記；用一次性巴氏吸管吸取單一菌落并接種到4.5mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)pH下降，液體由紅色變?yōu)辄S色時，重復(fù)步驟3和4 ；如此重復(fù)3次，得到純化的鴨支原體，加甘油_80°C保存。
[0021]本發(fā)明對培養(yǎng)基進(jìn)行了營養(yǎng)成分的篩選，通過添加CMRL-1066和馬血清，增加了鴨支原體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，使其富含核苷酸、維生素、膽固醇及蛋白質(zhì);通過添加酵母浸出液，提供了鴨支原體生長所需的氮源和微量元素;經(jīng)反復(fù)實驗表明，本發(fā)明的培養(yǎng)基能有效促進(jìn)鴨支原體的繁殖，僅24小時即可生長，生長滴度可達(dá)102—3 (XU/mL，而在未添加上述成分之前，生長48小時生長滴度才能達(dá)到103 (XU/mL;通過添加醋酸鉈、提高青霉素的濃度，可阻止環(huán)境中其他雜菌的生長，使培養(yǎng)基在2-8°C存儲時間從之前的1-2月延長到半年。
[0022]利用上述培養(yǎng)基對鴨支原體分離純化，是在固體培養(yǎng)基上分離菌落，將分離的菌落置于液體培養(yǎng)基中生長，然后進(jìn)行液體培養(yǎng)物的過濾、稀釋、涂板和挑單菌落增殖的純化步驟，重復(fù)上述步驟直至得到純化的鴨支原體。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行鴨支原體分離純化的成功率高，在正確采樣的前提下，通過最初病料接種、盲傳培養(yǎng)和分離，到后來液體培養(yǎng)物的過濾、稀釋、涂板、挑取單菌落增殖的純化步驟，均能從臨床病樣中成功分離純化出鴨支原體。
【具體實施方式】
[0023]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。
[0024]實施例1
本發(fā)明的鴨支原體培養(yǎng)基由液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基組成，具體為:
液體培養(yǎng)基配方為:10%的醋酸鉈溶液4.8mL/L，PPLO肉湯3 g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨
4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，1%的酚紅2mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基450mL/L，滅活的馬血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液
0.2g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L，余量為去離子水。
[0025]配制500ml本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的方法如下:將1L的三角瓶置于磁力攪拌機(jī)上，先量取100 mL的去離子水，緩慢滴加10%的醋酸鉈溶液2.4mL，然后依次稱取并加入PPLO肉湯
1.5g，葡萄糖2.5g，蛋白胨2.4g，胰蛋白胨5g，1%的酚紅2mL，充分混勻后用質(zhì)量百分濃度為20%的NaOH調(diào)pH值為7.8，121°C高壓滅菌15分鐘;冷卻至50-55°C，加入無菌的CMRL-1066培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺)225mL，滅活的馬血清90mL，酵母浸出液22.5mL，無菌的青霉素150萬單位(溶于20mL去離子水)，無菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液(0.lg溶于10mL去離子水)，無菌的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(0.lg溶于10mL去離子水)，用去離子水調(diào)至500ml，無菌條件下調(diào)pH值至7.8，置4°C冰箱備用。
[0026]固體培養(yǎng)基配方為:10%的醋酸鉈溶液4.8mL/L，PPL0肉湯3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，瓊脂粉12g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基450mL/L，滅活的馬血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液0.2g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L，余量為去離子水。
[0027]配制500mL本發(fā)明的固體培養(yǎng)基:將1L的三角瓶置于磁力攪機(jī)上，先量取100mL的去離子水，緩慢滴加10%的醋酸鉈溶液2.4mL，然后依次稱取PPL0肉湯1.5g，葡萄糖2.5g，蛋白胨2.4g，胰蛋白胨5g，瓊脂粉6g，充分混勻后用質(zhì)量百分濃度為20%的NaOH調(diào)pH值為7.8，121°C高壓滅菌15分鐘；放入50-55°C的水浴鍋中冷卻(此溫度下可防止瓊脂凝集及對后續(xù)添加物營養(yǎng)成分的破壞);加入無菌的CMRL-1066培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺)225mL，滅活的馬血清90mL，酵母浸出液22.5mL，無菌的青霉素150萬單位(溶于20 mL去離子水)，無菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液(0.lg溶于10mL去離子水)，無菌的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(0.1 g溶于10mL去離子水)，用去離子水調(diào)至500ml，混勻后倒平板，放置4°C冰箱的平皿罐內(nèi)備用。
[0028]上述培養(yǎng)基中酵母浸出液的制備方法為:稱取酵母粉200g，加入1000mL去離子水，在30°C下磁力攪拌1小時；10-15分鐘內(nèi)逐漸增加溫度到40°C;之后每分鐘增加5°C至沸點，煮沸3-5分鐘，冷卻至室溫，離心，取上清，依次經(jīng)0.8 μπι、0.45 μπι,0.22 μπι的濾器過濾后收集濾液，50mL分裝后放入-20°C備用。
[0029 ]本發(fā)明的鴨支原體培養(yǎng)基的活菌滴度(CCU)測定:
取11支試管，加液體培養(yǎng)基4.5mL /管，在第1管中加入0.5mL生長良好的培養(yǎng)液(鴨支原體模式株1340株:購自美國菌種保藏中心ATCC)，振蕩器混勻，換新的移液管，從第1管吸取0.5mL加入到第2管中，依次進(jìn)行10倍稀釋至第10管，最后一管中的0.5mL棄去;第11管為陰性對照。將試管放置37°C恒溫箱中靜置培養(yǎng)，每日觀察顏色變化，連續(xù)觀察10-12天，最后發(fā)生顏色變化的那管稀釋度就是該培養(yǎng)物的CCU滴度。第10天讀值，結(jié)果顯示培養(yǎng)液的含菌量為1X109 CCU/mL。
[0030]應(yīng)用實施例1制備的培養(yǎng)基分離純化鴨支原體的方法如下:
1)用無菌棉簽，從活體病鴨的氣管中取樣，立即將棉簽放入含有4.5 mL培養(yǎng)基的試管中用力攪拌擠壓，棄棉簽，并盡快放入37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0031]2) 24小時后，進(jìn)行第一代盲傳，將上述液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落生長;若此時，上述液體培養(yǎng)基PH下降，顏色由紅色變?yōu)辄S色，可按1:10的比例轉(zhuǎn)接新的液體培養(yǎng)基，若未發(fā)生PH值下降，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待顏色變黃轉(zhuǎn)接新的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。
[0032]3)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7天，低倍鏡下觀察菌落的生長情況，用接種環(huán)無菌刮取平板上的菌落接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長，再將變黃的培養(yǎng)物接種到固體培養(yǎng)基上;重復(fù)該步驟，直至得到支原體特征菌落。
[0033]4)將特征菌落接種到液體培養(yǎng)基中生長，顏色變黃后，用0.22μπι濾器過濾液體培養(yǎng)物;轉(zhuǎn)接200yL濾液到1.8mL液體培養(yǎng)基中做連續(xù)10倍稀釋(10—〔ΙΟ—7);將原液和稀釋液各5yL涂布固體培養(yǎng)基，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，可在低倍顯微鏡下觀察到分布均勻的支原體菌落，選取單個菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)液體由紅色變?yōu)辄S色后，重復(fù)該步驟;如此重復(fù)3次，即可得到純化的鴨支原體，加甘油于_80°C保存。
[0034]實施例2
本實施例與實施例1的不同之處在于:
液體培養(yǎng)基配方為:10%的醋酸鉈溶液4.5mL/L，PPLO肉湯5g/L，葡萄糖4g/L，蛋白胨4g/L，胰蛋白胨9g/L，1%的酚紅2.5mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基500mL/L，滅活的馬血清150mL/L，酵母浸出液55mL/L，青霉素250萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液0.lg/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L，余量為去離子水。
[0035]固體培養(yǎng)基配方為:10%的醋酸鉈溶液4.5mL/L，PPLO肉湯5g/L，葡萄糖4g/L，蛋白胨4g/L，胰蛋白胨9g/L，瓊脂粉10g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基500mL/L，滅活的馬血清150mL/L，酵母浸出液55mL/L，青霉素250萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液0.lg/L,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L，余量為去離子水。
[0036]其余部分均相同。
[0037]實施例3
本實施例與實施例1的不同之處在于:
液體培養(yǎng)基配方為:10%的醋酸鉈溶液6.0mL/L，PPL0肉湯4g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨6g/L，胰蛋白胨8g/L，1%的酚紅3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基480mL/L，滅活的馬血清170mL/L，酵母浸出液50mL/L，青霉素280萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液0.lg/L,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L，余量為去離子水。
[0038]固體培養(yǎng)基配方為:10%的醋酸鉈溶液6.0mL/L，PPLO肉湯4g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨6g/L，胰蛋白胨8g/L，瓊脂粉1 lg/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培養(yǎng)基480mL/L，滅活的