一種裂解組合物及其用途、試劑盒、利用該裂解組合物制備核酸的方法、核酸分析的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，特別涉及一種裂解組合物及其用途、試劑盒、利用該裂 解組合物制備核酸的方法、核酸分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光定量PCR(qPCR)，是一種基于多聚酶鏈反應PCR(PolymeraseChain Reaction)的在許多方面改進的DNA擴增技術(shù)。定量PCR在thermalcycler儀器中進行時 儀器通過發(fā)射特殊波長的光束照亮每一個DNA樣本以及探測激發(fā)突光團（fluorophonre) 發(fā)出的熒光。qPCR需要使用熒光探針或熒光引物，目標DNA在即時擴增時其變化的數(shù)量可 以通過一臺實時PCR儀器同時進行監(jiān)測。另外，qPCR還可以同時擴增一個或多個目標DNA 序列。
[0003]qPCR(quantitativePCR)在對DNA模板上要求嚴格，一般需要從生物樣品中提取 純凈DNA才能進行。常規(guī)繁瑣的提取DNA主要方法如下：（1)經(jīng)典常規(guī)的苯酚氯仿（phenol/ chloroformDNAextraction)抽提法時間長、抽提步驟繁瑣且毒性大，不能夠用于高通量 實驗。此外苯酚氯仿化學試劑已經(jīng)被證明是實驗室重要的致癌物質(zhì)，長期接觸將對操作人 員的身體造成不可逆的傷害，對健康與安全形成較大的威脅；（2)離子交換純化柱法（Spin column)，用silica膜收集DNA，步驟繁瑣，多次使用離心機和換離心管，實驗過程中DNA易 丟失，提取量少，且價格昂貴，并且還產(chǎn)生較多不易消除的廢料。上述2個方法都不利于高 通量；（3)磁珠法（Magnetbeads，又稱玻璃珠分離法）：用磁珠提純DNA方法步驟相對簡 便，較少換離心管，但也多個步驟，并且需要高價值昂貴自動化工作站特殊設備。，磁珠提純 DNA方法所采用的自動化工作站就是非常典型的高價值設備。此外，磁珠分離DNA法雖然較 少換離心管，但也多個步驟，并且需要昂貴的特殊設備。這些現(xiàn)有技術(shù)需要多次更換離心管 或多次清洗-收集DNA，容易導致樣品交叉污染。直接進行實時PCR而不需要提取DNA方法 的報道非常有限的。因此，提供一種無需經(jīng)過提純核酸、能夠直接用于核酸分析的裂解組合 物，試劑盒、用該裂解組合物制備核酸的方法、以及核酸分析的方法具有現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種裂解組合物及其用途、試劑盒、利用該裂解組合物制備 核酸的方法以及核酸分析的方法。該裂解組合物可以快速簡捷制取核酸直接用于核酸分 析。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種裂解組合物，包括A或B或兩者的組合物；
[0007]所述A選自NaOH，Κ0Η或者Ca(0H) 2 ;所述B為PEG。
[0008]PEG，聚乙二醇。也稱為聚（環(huán)氧乙烯）（ΡΕ0)或聚氧乙烯（Ρ0Ε)，是指環(huán)氧乙烷的 寡聚物或聚合物。這三個名稱現(xiàn)今一般為同義詞，但歷史上聚乙二醇往往是指分子質(zhì)量低 于20,OOOg/mol的低聚物和聚合物，PEO是指分子量超過20, 000的聚合物，POE則可指任何 分子質(zhì)量的聚合物。PE0以及P0E根據(jù)分子量的不同，可為液體或低熔點液體。由于鏈長的 影響，不同分子量的聚乙二醇往往有不同的物理性質(zhì)（如黏度）及不同的應用。作為優(yōu)選， PEG的分子量為100~2000。
[0009] 本發(fā)明的一些實施例中，裂解組合物中所述A的濃度為0. 1~200mmol/L，所述B 的濃度為1~200mg/mL。
[0010] 本發(fā)明的一些實施例中，裂解組合物還包括反應終止物。在本發(fā)明的一些實施例 中，反應終止物可以為終止裂解反應的物質(zhì)。作為優(yōu)選，所述反應終止物為TurboBuffer。 任何可以終止生物樣品裂解反應的試劑均可以應用，本發(fā)明在此不作限定。
[0011] 本發(fā)明的一些實施例中，當所述裂解組合物中包括A和B時，所述A與所述B的摩 爾比為 〇· 1 ~200 :0· 45 ~1. 05。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述裂解組合物用于裂解生物樣品制備核酸的應用。
[0013] 在本發(fā)明的一些實施例中，所述生物樣品與所述裂解組合物的質(zhì)量體積比為：1: 1 ~1 :10 (以g/mL計）。
[0014] 本發(fā)明的一些實施例中，所述生物樣品包括真核生物或原核生物。
[0015] 本發(fā)明的一些實施例中，所述真核生物包括動物、植物、微生物。
[0016] 本發(fā)明的一些實施例中，所述動物包括動物液體組織、動物固體組織。
[0017] 本發(fā)明的一些實施例中，所述動物液體組織包括唾液、尿液、血液、胃液、胸積水、 肺部積水、腮腺細胞、淋巴液、骨髓液、奶液、眼淚、精液、脊髓液，腦髓，羊水，關(guān)節(jié)液或鼻液 中的一種或兩者以上的組合物。
[0018] 本發(fā)明的一些實施例中，所述動物固體組織包括腸組織、喉嚨組織、腫瘤組織、細 胞系、肺部組織肝組織、胃組織、腎組織、胰腺組織、前列腺組織、子宮組織、卵巢組織、膽囊 組織、心組織、皮組織、腦或糞便中的一種或兩者以上的混合物。
[0019] 本發(fā)明中，制備得到的所述核酸不需提純直接用于核酸分析。
[0020] 本發(fā)明的一些實施例中，所述核酸分析包括擴增反應、酶反應、突變體位點檢測或 SNPs檢測。
[0021] 本發(fā)明的一些實施例中，所述核酸分析為PCR、連接酶鏈反應、缺口 -LCR、修復鏈 反應、轉(zhuǎn)錄介導的擴增、自主序列復制、目標多核苷酸系列的選擇性擴增、共有序列引物聚 合酶鏈反應、隨機引物聚合酶鏈反應、基于核酸序列的擴增、鏈置換擴增、環(huán)介導等溫擴增、 DNA甲基化反應、逆轉(zhuǎn)錄反應、DNA連接反應、核酸酶介導反應。
[0022] 本發(fā)明的另一些實施例中，所述PCR反應包括常規(guī)PCR、RT-PCR(RNA)、qPCR。
[0023] 本發(fā)明的另一些實施例中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應包括普通RNA逆轉(zhuǎn)錄、RNAi逆轉(zhuǎn)錄、 SiRNA、LncRNA或miRNA逆轉(zhuǎn)錄。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括上文所述的裂解組合物。
[0025] 本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的試劑盒中當所述裂解組合物中包括A和B 時，所述A與所述B的摩爾比為0. 1~200 :0. 45~1. 05。
[0026] 本發(fā)明還提供了上述試劑盒用于裂解生物樣品制備核酸的應用。
[0027] 在本發(fā)明的一些實施例中，所述生物樣品與所述試劑盒中的裂解組合物的質(zhì)量體 積比為：1 :1~1 :1〇 (以g/mL計）。
[0028] 本發(fā)明的一些實施例中，利用上述試劑盒裂解生物樣品制備的所述核酸不需提純 直接即可用于核酸分析。
[0029] 本發(fā)明的一些實施例中，所述核酸分析包括酶反應、擴增反應、突變體位點檢測或 SNPs檢測。
[0030] 本發(fā)明的一些實施例中，所述核酸分析為PCR、連接酶鏈反應、缺口 -LCR、修復鏈 反應、轉(zhuǎn)錄介導的擴增、自主序列復制、目標多核苷酸系列的選擇性擴增、共有序列引物聚 合酶鏈反應、隨機引物聚合酶鏈反應、基于核酸序列的擴增、鏈置換擴增、環(huán)介導等溫擴增、 DNA甲基化反應、逆轉(zhuǎn)錄反應、DNA連接反應、核酸酶介導反應。
[0031] 本發(fā)明的另一些實施例中，所述PCR反應包括常規(guī)PCR、RT-PCR、（RNA)、qPCR。
[0032] 本發(fā)明的另一些實施例中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應包括普通RNA逆轉(zhuǎn)錄、RNAi逆轉(zhuǎn)錄或 miRNA逆轉(zhuǎn)錄。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種制備核酸的方法，利用上文所述的裂解組合物裂解生物樣 品，制得核酸。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種核酸分析的方法，所述核酸由上文所述的裂解組合物裂解生 物樣品制得，不需提純直接用于核酸分析。
[0035] 具體的，本發(fā)明使用裂解組合物，從組織裂解后到核酸分析流程如下：
[0036] 1，組織、細胞等生物樣品中加入本發(fā)明提供的裂解組合物，所述生物樣品與所述 裂解組合物的質(zhì)量體積比為：1 :1~1 :1〇(以g/mL計）
[0037] 2,高溫（30°C~90°C)，處理10分鐘~8小時；
[0038] 3,裂解后加Turbobuffer(上海鴻慧健康科技有限公司），終止反應；
[0039] 4,離心后進行核酸分析。
[0040] 本發(fā)明用人類及其他生物多種組織和細胞經(jīng)過一種新的裂解組合物，使核酸從生 物樣品中得以高效釋放并免提核酸，僅在一個離心管中2個步驟完成而直接為核酸分析提 供模板，以代替常規(guī)必須先裂解細胞提取模板核酸才能作核酸分析的方法。
[0041] 具體的，本發(fā)明使用裂解組合物，從組織裂解后到qPCR步驟反應流程如下：
[0042] 1、組織、細胞等生物樣品中加入本發(fā)明提供的裂解組合物，所述生物樣品與所述 裂解組合物的質(zhì)量體積比為：1 :1~1 :1〇(以g/mL計）；
[0043] 2、高溫（30°C~90°C)，處理10分鐘~8小時；
[0044] 3、裂解后加Turbobuffer(上海鴻慧健康科技有限公司），終止反應；
[0045] 4、離心后進行qPCR。
[0046] 在本發(fā)明的一些實施例中，用常規(guī)方法制備的核酸作為對照組，以本發(fā)明提供的 上述裂解組合物制備的核酸作為實驗組，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的上述裂解組合物制備的核酸可 以不經(jīng)提取、即可直接為核酸分析提供模板，效果與對照組無顯著差異（P> 〇. 05)。
[0047] 本發(fā)明提供一種裂解組合物及其用途、試劑盒、利用該裂解組合物制備核酸的方 法、核酸分析的方法。該裂解組合物可以快速簡捷制取核酸直接用于核酸分析。
[0048] 本發(fā)明提供一種新的裂解組合物，人類及其他生物多種組織和細胞經(jīng)該裂解組 合物裂解，使核酸從細胞中得以高效釋放并免提核酸，僅在一個離心管中2個步驟完成而 直接為核酸分析提供模板，以代替常規(guī)必須先裂解細胞提取模板核酸才能作核酸分析的方 法。
[0049] 本發(fā)明采取極簡易的僅一步裂解不用純化核酸的程序，明顯節(jié)省時間、減少人工 和耗材費用、更重要的是減少樣品交叉污染，以及樣品對操作人員的感染，不損失核酸樣品 (尤其對低拷貝、痕量的特殊樣品，如早期疾病細胞組織）。其技術(shù)方法具有明顯的快速便 捷，有利于高通量和高靈敏度的生物樣品分析的特點。此外，本方法避免使用有毒致癌物質(zhì) 有利于健康和綠色環(huán)保，步驟少，流程簡單，耗時短，簡便，制備樣品一管不換（減少污染）， 適合高通量，高效，廢物少，環(huán)保好（無致癌物、少耗料、少廢料）。不損失核酸有利于痕量樣 品檢測。
【附圖說明】
[0050] 圖1示本發(fā)明提供的裂解組合物制備核酸與常規(guī)方法的比較；
[0051] 圖2示實時熒光定量PCR(qPCR)方法作BRAF基因突變分子檢測擴增圖；其中，組 織樣本1為手術(shù)腸息肉組織（取自于貴州省中醫(yī)院附屬第一醫(yī)院）、組織樣本2為手術(shù)食管 癌組織（取自于蘇州大學附屬第一醫(yī)院）、#3為胸積水組織塊（取自福建南京軍區(qū)福州總 醫(yī)院）、#4和#5為正常獨立兩個人，NTC(用水作無模板負對照