;
[0089] A與B的摩爾比為0· 1:1. 05 ;
[0090] 制得裂解組合物。
[0091] 實(shí)施例3裂解組合物的制備
[0092] 組分A:濃度為 100mmol/L的Κ0Η;
[0093] 組分B:濃度為100mg/mL的PEG(分子量為1000);
[0094] A與B的摩爾比為：200:0. 45 ;
[0095] 制得裂解組合物。
[0096] 實(shí)施例4裂解組合物的制備
[0097] 組分A:濃度為 100mmol/L的Κ0Η;
[0098] 組分B:濃度為100mg/mL的PEG(分子量為1000);
[0099] 反應(yīng)終止物:Turbobuffer。
[0100] A、B、反應(yīng)終止物的摩爾比為100:0. 8 ;
[0101] 制得裂解組合物。
[0102] 實(shí)施例5裂解組合物的制備
[0103] 組分A:濃度為50mmol/L的Κ0Η，即得。
[0104] 實(shí)施例6裂解組合物的制備
[0105] 組分B:濃度為50mg/mL的PEG(分子量為800);即得。
[0106] 實(shí)施例7BRAF基因突變分子檢測在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用
[0107] 使用實(shí)施例4制備的裂解組合物對人類基因BRAFV600E進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 基因突變檢測。多種人類樣品經(jīng)過本發(fā)明提供的裂解組合物，直接進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
[0108] 包括：（1)包含反應(yīng)所需的全部各種試劑：Taq酶、FAM熒光探針與正反向引物、 Buffer、Mg2+ 以及dNTPs。⑵陰性對照：(lng/μL)HmgDNA(3) 1-2μL樣品裂解組合物（4) 稀釋液：DNase_freeWater。
[0109] 本發(fā)明的試劑用于BRAF基因突變檢測方法具有快速便捷；可以免抽提DNA直接 qPCR;減少污染，減少樣品用量；且設(shè)置雙重質(zhì)控點(diǎn)，檢測結(jié)果穩(wěn)定，適合標(biāo)準(zhǔn)化和高通量。
[0110] 實(shí)驗(yàn)流程：
[0111] 樣本處理（以人類腸組織、食管組織、尿液和唾液為例）
[0112] 1.于樣品中加入約體積1 :1~10 (V/V)的實(shí)施例4制備的裂解組合物；
[0113] 2.將離心管放入heatingblock，3CTC-9CTC，約 5min_3h.，
[0114] 3.終止反應(yīng)：加入200μL反應(yīng)終丨h(huán)液Turbobuffer,短暫渦旋后離心(lOOOOrpm， 2min)，并不需要純化提取核酸，取2μL細(xì)胞粗裂解液即可作為下面核酸反應(yīng)的模板。
[0115] 4.qPCR反應(yīng)（ΑΒΙ7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測平臺）：
[0117] 三·qPCR反應(yīng)程序（pikoreal檢測平臺）
[0120] 檢測結(jié)果（pikoreal檢測平臺）見圖2。
[0121] 本發(fā)明的BRAF基因突變檢測方法具有快速便捷；可以免抽提DNA直接qPCR;減少 污染，減少樣品用量；且設(shè)置雙重質(zhì)控點(diǎn)，檢測結(jié)果穩(wěn)定，適合標(biāo)準(zhǔn)化和高通量。
[0122] 實(shí)施例8BRAF基因擴(kuò)增
[0123] 樣本處理方法：同實(shí)施例7 ;
[0124] qPCR擴(kuò)增基因：BRAF基因，qPCR擴(kuò)增平臺（ABI公司）：ABI7500qPCR反應(yīng)體系：
[0127] BRAF基因探針（probe)，引物序列如下：
[0128]
[0129] qPCR反應(yīng)程序：
[0131] 1.結(jié)腸癌組織和肺癌胸積水組織塊
[0132] 肺癌胸積水組織塊來源：福建省南京軍區(qū)福州總醫(yī)院醫(yī)院。樣品中有肉眼可見的 組織塊（腺癌細(xì)胞）。
[0133] 結(jié)腸癌組織來源：貴州省貴陽市中醫(yī)醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，樣品為手術(shù)切除組織。
[0134] 固體樣品處理方法見實(shí)例7樣本組織處理方法描述。其他條件同上。其中，曲 線1示腸組織 _End〇-ref;曲線2示gDNA-Endo-ref-neg.C(20ng);曲線3示胸積水組織 塊-Endo-ref;曲線4示腸組織-Mut;曲線5示gDNA-Mut-neg.C(20ng);曲線6示胸積水組 織塊-Mut。
[0135]【注：gDNA:人類基因組DNA，來自于用常規(guī)抽提純化DNA法，作為實(shí)驗(yàn)對照（Roche 公司產(chǎn)品），Endo=endogenousDNA(內(nèi)源DNA)，ref=reference(參照），Mut= mutation(突變體），C=Countrol(對照）】
[0136]
[0137] 結(jié)果分析（ABI7500平臺）：見圖3。
[0138]ΔCt=Mut(樣本）-Endo-ref(樣本）
[0139]陰性對照（neg.C)ΔCt= 9. 16
[0140] 腸組織樣本ΛCt= 10. 78>8· 5 (ΛCt>8. 5為試劑盒cutoff對非突變體的設(shè)定） 胸積水組織塊樣本ΔCt= 11. 23 > 8. 5 (ΛCt>8. 5為試劑盒cutoff對非突變體的設(shè)定）
[0141] 因此2個(gè)樣本皆為BRAF突變陰性樣本，是野生型。
[0142] 結(jié)論：BRAF突變檢測試劑盒能在ABI7500平臺方便快捷檢測多種類型臨床組織樣 本，特異性好，靈敏度高。
[0143] 2、食管癌組織和結(jié)腸息肉組織
[0144] 樣本來源：
[0145] 食管癌組織來源：蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院；結(jié)腸組織息肉（與上面是不同的組 織）：貴州省貴陽市中醫(yī)院第一附屬醫(yī)院。
[0146] 其他條件同上。
[0147]q-PCR結(jié)果（ABIPicoreal平臺）：
[0148] 見圖4。其中，曲線1示腸組織-Endo-ref;曲線2示食管組織-Endo-ref;曲線3 示gDNAneg.C(lng);曲線4示食管組織-Mut;曲線5示腸組織-Mut;曲線6示gDNAneg. C(lng)-Mut〇
[0149]
[0150]結(jié)果：ΔCt=Mut(樣本）-Endoref(樣本）
[0151]陰性對照（neg.C)ΔCt= 9· 79
[0152] 腸組織樣本ΛCt= 17. 46>8· 5 (>8· 5為試劑盒對突變體cutoff設(shè)定）
[0153] 食管組織樣本ΛCt= 16. 1 > 8. 5 (>8. 5為試劑盒對突變體cutoff設(shè)定）
[0154] 因此2樣本皆為BRAF突變陰性樣本。
[0155] 結(jié)論：BRAF突變檢測試劑盒能在Pikoreal平臺方便快捷檢測各類型臨床組織樣 本，特異性好，靈敏度高。
[0156] 3、胃液和痰液作BRAF基因qPCR擴(kuò)增以及檢測點(diǎn)突變體的應(yīng)用：
[0157] 液體樣品處理方法同實(shí)施例9、實(shí)施例10中IL28SNPs液體樣本組織處理方法描 述。
[0158] 其他條件同上。
[0159] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0160] (ABI Pikoreal平臺）：見圖5。
[0161] 線條1示痰液：Endo_ref(內(nèi)源參照）
[0162]線條2示gDNA*(20ng) :End〇-ref_C (內(nèi)源參照對照）
[0163] 線條3示胃液：End〇-ref(內(nèi)源參照）
[0164]線條 4 示gDNA*(20ng) :Mut_neg_C(突變體陰性對照）·
[0165] 線條5示痰液：Mut(突變檢測，樣本為BRAF野生型，即突變體陰性）
[0166] 上述結(jié)果表明，樣品#1-5都有qPCR擴(kuò)增以及#4和5對BRAF點(diǎn)突變檢測結(jié)果：#5 樣本BRAF突變檢測結(jié)果表明該痰液樣本是BRAF野生型。
[0167]
[0168] 結(jié)論：BRAF突變檢測試劑盒能在ABI7500平臺方便快捷檢測多種類型臨床組織樣 本，特異性好，靈敏度高。
[0169] 4、血液，唾液，尿液BRAF基因qPCR擴(kuò)增以及突變體檢測
[0170] 血液，唾液，尿液處理方法參見實(shí)施例9、實(shí)施例10中IL28SNPs液體樣本組織處 理方法描述。
[0171] 其他條件同上。見圖6。
[0172] 其中，曲線1示gDNA:Endoref-neg.C(20ng)(人類基因組DNA內(nèi)源參照，BRAF突變 陰性對照）；曲線2示血液-Endo-ref(內(nèi)源參照）；曲線3示唾液-Endo-ref(內(nèi)源參照）； 曲線4示尿液-Endo-ref(內(nèi)源參照）；曲線5示gDNA:Mut-neg.C(20ng)(人類基因組DNA BRAF突變檢測-陰性對照）；曲線6示血液:Mut(突變體檢測）
[0173](血液BRAF突變檢測結(jié)果表明該樣本是BRAF野生型。BRAF突變體誘發(fā)癌癥情況 在中國比率不高。）
[0174] 結(jié)論：BRAF突變檢測試劑盒能方便快捷檢測多種類型臨床組織樣本，特異性好， 靈敏度高。
[0175]
[0176] 5、胸積水BRAF基因qPCR擴(kuò)增以及突變體檢測結(jié)果
[0177] 胸積水采集樣品來自福建省南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，樣品中有肉眼可見的組織塊和 液體，樣本處理方法參見IL28SNPs液體樣本組織處理方法描述。其他條件同上。見圖7。
[0178] 其中，曲線1示gDNA-Endo-ref-neg. C(20ng)(人類基因組DNA內(nèi)源參照，BRAF陰 性對照）；曲線2示胸積水-Endo-ref(內(nèi)源參照）；曲線3示gDNA-Mut-neg. C (20ng)(人類 基因組DNA BRAF突變檢測-陰性對照）；曲線4示胸積水-Mut(突變檢測）。
[0179] 檢測結(jié)果：
[0182] 結(jié)論：本發(fā)明的突變檢測試劑盒能在ABI Picoreal平臺方便快捷檢測多種類型 臨床組織樣本，特異性好，靈敏度高。
[0183] 綜合上述實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果表明該人類樣品可以用qPCR方法擴(kuò)增，樣本全是野生 型，不是突變體型。固體材料樣品比液體包含更多DNA，因而擴(kuò)增更高（cn值更小靠左）； 本發(fā)明的不提DNA裂解后混合液與對照提純的gDNA的結(jié)果（circlenumber= 23)等同 (circlenumber在 22-32 之間，在cutoff= 35 以內(nèi)）。
[0184] 本發(fā)明的BRAF基因突變檢測方法具有快速便捷；可以免抽提DNA直接qPCR;減少 污染，減少樣品用量；且設(shè)置雙重控點(diǎn)，檢測結(jié)果穩(wěn)定，適合標(biāo)準(zhǔn)化和高通量。
[0185]實(shí)施例9唾液SNP-IL28B_a(實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SNPs多態(tài)性）：
[0186] 1.取唾液樣本10μL于1. 5ml離心管中，按1:1比例加入實(shí)施例1制備的裂解組 合物；
[0187] 4.將離心管渦旋10s，5Krpm離心lmin;
[0188] 5.將離心管置于Heatingblock(30-90C)靜置（30min-2hr);
[0189] 6.加入 20