us to theacetylcholinesterase knockout mouse.(2005)Chemico-B1logical Interact1ns157-158:71-78.
[0025]20.Zhang, Z.L., Zou, ff.G., Lou, C.X, et al., An armed oncolytic adenovirussystem, ZD55-gene, demonstrating potentantitumoral efficacy.Cell Research(2003)；13(6):481-489.
[0026]21.Liu, M.，Li, Z.H.，Xu, F.J.，Lai, L.H.，Wang, Q.Q.，Tang, G.P.，Yang, ff.T.An oligopeptide ligand-mediated therapeutic gene nanocomplex for livercancer-targeted therapy.B1materials2012, 33:2240-2250.
[0027]22.Wang, J.，Tang, G.，Shen, J.，Hu，Q.，Xu, F.，Wang, Q.，Li, Z.，Yang, ff.A genenanocomplex conjugated with monoclonal antibodies for targeted therapy ofhepatocellular carcinoma.B1materials2012, 33:4597-4607.
[0028]23.Ellman，G..L.，Coutney, K.D.，Andres jr.，V.，F(xiàn)eather-Stone, R.M.(1961)B1chem Pharmacol7:88-95.
[0029]24.Dean M, Fojo, T., Bates, S.Tumour stem cells and drug resistance.(2005)Nature Reviews Cancer 5:275-284.
[0030]25.Takaishi，S.，Okumura, T.，Tu，S.，Wang, S.S.，Shibata，ff.，Vigneshwaran, R.，Gordon, S.A.，Shimada，Y.，Wang, T.C.1dentificat1n of gastric cancer stem cellsusing the cell surface marker CD44.(2009)Stem Cells27:1006-1020.。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0031 ] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種更新穎，安全，有效的干預(yù)腫瘤的的技術(shù)方案。具體涉及攜帶人AChE基因的溶瘤病毒載體ZD55及其應(yīng)用，尤其是溶瘤病毒載體ZD55攜帶并過(guò)表達(dá)人AChE (hAChE)基因在制備治療腫瘤制劑中的用途，所述的腫瘤選自胃癌，食道癌，結(jié)腸癌，肝癌，胰腺癌或子宮頸癌。
[0032]本發(fā)明提供了構(gòu)建ZD55_hAChE的方法和在體內(nèi)體干預(yù)腫瘤的機(jī)制和應(yīng)用試驗(yàn)。
[0033]本發(fā)明中，基于平衡失調(diào)的AChE和Ach系統(tǒng)在腫瘤的產(chǎn)生和生長(zhǎng)中可能的相互關(guān)系和作用，認(rèn)為補(bǔ)充hAChE來(lái)調(diào)整Ach與AChE的平衡是合理并可驗(yàn)證的；由于大部分AChE是附著在細(xì)胞膜上的，生物提取純化大量AChE非常困難，用常規(guī)基因工程技術(shù)方法生產(chǎn)的商品化AChE價(jià)格非常昂貴，如Sigma-Aldrich公司的價(jià)格是lmgAChE6，670人民幣(18)，人工合成至今尚未成功；考慮一般蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性都比DNA核苷酸差，本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單易行，且價(jià)格不高的hAChE基因質(zhì)粒導(dǎo)入，利用自身的活細(xì)胞組織作為化工廠來(lái)生產(chǎn)AChE蛋白，從而補(bǔ)償和糾正自身AChE的缺失，達(dá)到調(diào)整AChE和Ach系統(tǒng)的平衡目的。
[0034]本發(fā)明選用溶瘤病毒ZD55作為攜帶和過(guò)表達(dá)hAChE基因質(zhì)粒，進(jìn)行了體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，由于癌細(xì)胞或癌組織內(nèi)外微環(huán)境中hAChE活性明顯低下，因此不能快速有效地水解底物乙酰膽堿(Ach)，通過(guò)溶瘤病毒載體ZD55攜帶并過(guò)表達(dá)hAChE基因(ZD55-hAChE)活細(xì)胞組織可以生產(chǎn)hAChE從而糾正AChE和Ach的平衡，達(dá)到體內(nèi)體外顯著抗癌效果。
[0035]本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ZD55_hAChE抗癌效應(yīng)是通過(guò)多途徑聯(lián)合作用，包括調(diào)整癌細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境AChE活性水平，抑制癌細(xì)胞活力，引起升高的癌細(xì)胞線粒體膜電位下降，下調(diào)多個(gè)在線粒體和細(xì)胞核中跟凋亡密切相關(guān)因子前體的表達(dá)，上調(diào)裂解的PARP水平，減弱腫瘤細(xì)胞克隆能力，最后導(dǎo)致癌細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞凋亡；而且，能導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡的ZD55-hAChE劑量不能殺傷正常或非癌細(xì)胞，所以具有安全性。
[0036]本發(fā)明中，所述的ZD55是由中科院上海生化細(xì)胞所提供(劉新垣院士課題組于2003構(gòu)建)，
[0037]本發(fā)明中，hAChE基因質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)的Oksana Lockridge教授實(shí)驗(yàn)室。此質(zhì)粒構(gòu)建是通過(guò)克隆 1.9kb hAChEcDNA 到 pAAV-MCS 質(zhì)粒(catalog#240071 AAV Helper-FreeSystem, Strategene, Lajolla, CA).hAChE基因質(zhì)粒包括在 signal peptide 的 31 個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)581個(gè)氛基酸的AChE亞單位(access1n#NM 015831)，和在FLAG epitope的8個(gè)氛基酸。攜帶AChEcDNA的載體含CMV啟動(dòng)子(promoter)和beta-globin intron來(lái)增強(qiáng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)；所述的hAChEcDNA包含外顯子2，3，4，和6，可以編碼最廣泛存在的hAChET-型；整個(gè)質(zhì)粒有6512堿基對(duì)；本發(fā)明中用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5-alpha轉(zhuǎn)化此質(zhì)粒，用內(nèi)切酶切割得到hAChEcDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，再測(cè)序檢驗(yàn)，確定所得到的質(zhì)粒的正確性。
[0038]本發(fā)明中，將構(gòu)建的ZD55-hAChE經(jīng)pBGHE3轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞。所用生產(chǎn)鑒定病毒和病毒滴度測(cè)定方法是本領(lǐng)域人員熟知的。
[0039]本發(fā)明中，所述AChE活性測(cè)定采用本領(lǐng)域常規(guī)應(yīng)用的改良Ellman法(23)，0D是指在波長(zhǎng)405nm的反應(yīng)產(chǎn)物吸光度。
[0040]本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)M0CK是指未經(jīng)轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞；ZD55是指不攜帶hAChE的溶瘤病毒；Ad.AChE是指非復(fù)制性腺病毒攜帶hAChE ；ZD55-hAChE是指溶瘤病毒載體ZD55攜帶hAChE基因；病毒濃度以摩爾(Μ0Ι)表示。
[0041]本發(fā)明中，用常規(guī)的MTT細(xì)胞活力檢測(cè)法證實(shí)ZD55_hAChE體外抗癌有效劑量(0.1-50摩爾)不殺傷正常細(xì)胞成纖維細(xì)胞(Fibroblast)和胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)。
[0042]本發(fā)明證實(shí)ZD55_hAChE抗癌效應(yīng)是通過(guò)糾正AChE和Ach在細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境的平衡達(dá)到多途徑聯(lián)合抗癌效果；例如，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用2摩爾ZD55-hAChE感染胃癌細(xì)胞AGS48小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)液(Medium)和細(xì)胞漿(cell Lysate)中的AChE活性明顯升高。
[0043]本發(fā)明通過(guò)常規(guī)的MTT法測(cè)定證實(shí)不同滴度(2，5，10,50摩爾)ZD55_hAChE在體外對(duì)多種人類癌細(xì)胞，如胃癌AGS，NC1-N87，MGC80-3細(xì)胞株，肝癌細(xì)胞株Huh_7，SMMC-7721細(xì)胞株，宮頸癌HeLa，胰腺癌細(xì)胞株AsPC-l，BXPC-3，腸癌細(xì)胞株SW480，HCT116有顯著抑制腫瘤活性作用。ZD55-hAChE的抑瘤活性效應(yīng)顯著優(yōu)于Ad.AChE和ZD55。
[0044]本發(fā)明證實(shí)不同滴度ZD55_hAChE顯著抑制不同癌細(xì)胞株的克隆能力。
[0045]本發(fā)明證實(shí)ZD55_hAChE轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞后經(jīng)常規(guī)Hoechst 333258染色顯示腫瘤細(xì)胞核濃縮，破碎，細(xì)胞凋亡。
[0046]本發(fā)明證實(shí)癌細(xì)胞經(jīng)ZD55_hAChE轉(zhuǎn)染后，常規(guī)的Western Blotting分析顯不線粒體，細(xì)胞核中的關(guān)鍵凋亡因子procaspase-3, procaspase-8, procaspase-9和poly-ADP-ribose-polymerase (PARP)前體的表達(dá)水平得到減低，而裂解的PARP水平上調(diào)。
[0047]所用 抗 procaspase-3, procaspase-8, procaspase-9 和poly-ADP-ribose-polymerase(PARP)第一抗體分別是 sc-69456, #9746, #9508,sc-7150o sc-69456 和 sc-7150 抗體購(gòu)自 SantaCruzB1technology(Santa Cruz, CA),#9746 和 #9508 抗體購(gòu)自 CellSignalingTechnology (Beverly, MA),內(nèi)參 GAPDH 抗體CW002A購(gòu)自CoffinB1science (Beijing, China)。孵育印跡用辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的二抗(SantaCruzB1technology)。用購(gòu)自 Pierce, Rockford, IL 的化學(xué)突光(chemiluminescence)增強(qiáng)可見(jiàn)度。
[0048]本發(fā)明證實(shí)癌細(xì)胞經(jīng)ZD55-hAChE轉(zhuǎn)染后，常規(guī)Annexin V-FITC/PI染色經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，腫瘤細(xì)胞的凋亡比例顯著高于未轉(zhuǎn)染的或經(jīng)Ad.AChE, ZD55空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
[0049]本發(fā)明證實(shí)癌細(xì)胞經(jīng)ZD55_hAChE轉(zhuǎn)染后，用常規(guī)JC-1染色，癌細(xì)胞線粒體膜電位下降比例明顯。
[0050]基于最新的研究認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞的存在是導(dǎo)致腫瘤耐藥性，手術(shù)切除，放療，化療后仍能復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因；根據(jù)Takaishi S等研究人員的發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面標(biāo)志CD44+的胃癌細(xì)胞屬于胃癌干細(xì)胞，本發(fā)明據(jù)此用APC結(jié)合的CD44抗體篩選CD44+的胃癌AGS細(xì)胞作為胃癌干細(xì)胞；本發(fā)明通過(guò)常規(guī)的MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)⑶44+AGS細(xì)胞在0.1摩爾ZD55-hAChE轉(zhuǎn)染后能顯示抑制腫瘤干細(xì)胞