基于聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的多功能超分子基因運載系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類非病毒基因轉(zhuǎn)染的載體及其制備方法，具體是涉及一種基于聚乙 烯亞胺-環(huán)糊精的多功能超分子基因運載系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是惡性程度極高的腫瘤，每年新發(fā)病例55.4萬，而死亡病例也高達52.1萬。肝 癌治療效果不佳、預(yù)后不良已成公認(rèn)的臨床治療難題之一，這可能和肝癌復(fù)雜的惡性增殖 機制有關(guān)，而miRNA表達突變是其中極其重要的調(diào)節(jié)機制。miRNA是一類長度為20-24個核苷 酸的非編碼RNA，作用于轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)。研究表明，部分關(guān)鍵miRNA通過調(diào)節(jié)癌基因表達和 腫瘤信號通路來抑制惡性腫瘤的生長，多種惡性腫瘤中這些miRNA的調(diào)節(jié)通路出現(xiàn)異常變 化，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸和疾病的快速進展。miRNA在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著非常 重要的作用，肝癌中的111丨1?-16、111丨1?-343、111丨1?-1993、111丨1?-139等111丨1?祖表達水平明顯下調(diào)，而 miR-21、miR-92a、miR-126、miR-122、miR-223 等miRNA表達水平卻上調(diào)，形成了復(fù)雜的miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及到線粒體介導(dǎo)的凋亡通路、細胞周期檢查點、受體酪氨酸激酶通路等。
[0003] miR-34a是miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中極其重要的一個節(jié)點，主要有阻滯細胞周期、促進細 胞衰老、誘導(dǎo)細胞凋亡、阻止細胞迀移等生理功能。miR-34a直接受上游p53的調(diào)節(jié)，正常生 理環(huán)境中，DNA損傷激活的p53基因，與miR-34a啟動子結(jié)合并上調(diào)miRNA的表達;在肝癌病理 環(huán)境中，P53保守DNA結(jié)合序列中CpG島被甲基化，阻礙了p53對miR-34a的激活，從而抑制了 上調(diào)miR-34a的正常生理過程。在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，miR-34a表達偏低或缺 失。
[0004] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，有許多miRNA參與了肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，而且一些miRNA被 證明可以用于肝癌的臨床治療，miR-34a就是其中的主要代表分子，其具有重要的臨床應(yīng)用 前景。miR-34a替代療法通過輸送miR-34a至肝癌細胞內(nèi)，恢復(fù)胞內(nèi)的miR-34a表達水平，從 而逆轉(zhuǎn)病理情況下因P53突變導(dǎo)致的miR-34a表達缺失，達到負(fù)性調(diào)節(jié)肝癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移 的目的。miR-34a基因療法中有2點必不可少：（1)基因載體，裸miRNA基本不可能在體內(nèi)復(fù)雜 的生理環(huán)境中（如循環(huán)和組織屏障、內(nèi)吞后的溶酶體分解作用等)到達肝癌細胞內(nèi)產(chǎn)生抗腫 瘤作用，需要通過合適的基因載體協(xié)助才能達到滿意的藥代動力學(xué)和轉(zhuǎn)染效率，來發(fā)揮治 療效果；（2)運載功能性(如肝癌革E1向性、控釋能力等），缺少革E1向性會導(dǎo)致高表達miR-34a損 傷正常細胞的情況，對肝癌細胞的高度特異性轉(zhuǎn)染可最大程度減少此類不良反應(yīng)的發(fā)生 率，而缺乏控釋作用可導(dǎo)致基因在體內(nèi)循環(huán)運輸過程中提前釋放，造成靶器官內(nèi)生物利用 度降低和循環(huán)中游離基因藥物的不良反應(yīng)。MirnaTherapeutics公司基于miR-34a研發(fā)了 一種名為MRX34的基因藥物，以脂質(zhì)體介導(dǎo)miR-34a對肝癌的轉(zhuǎn)染，目前正在進行I期臨床試 驗[15] 〇MRX34通過靜脈給藥，抑制24種已知的肝癌相關(guān)基因來治療肝癌，但同時其靶向性 的缺失導(dǎo)致了正常細胞中的外源性miR-34a過表達，產(chǎn)生脫靶的不良反應(yīng)，這也正是目前臨 床應(yīng)用載體介導(dǎo)的miR-34a治療過程中亟需解決的問題。因此，研發(fā)一種同時具有高效轉(zhuǎn)染 能力、敏感控釋和肝癌靶向性的基因藥物運載系統(tǒng)就非常有必要。
[0005] 近年來，隨著功能性納米材料研究的逐漸深入，借助納米技術(shù)可以解決多種臨床 問題，特別是作為基因載體的納米微粒研究日趨成熟，通過功能性納米載藥系統(tǒng)來改進基 因的釋藥方式、體內(nèi)分布、不良反應(yīng)，也變得更加簡單易行。在抗腫瘤基因治療中，納米技術(shù) 帶來的功能性運載具有重要的臨床意義?；蜉d體功能性主要體現(xiàn)在：（1)應(yīng)激控釋能力； (2)以材料可降解性為主要特點的生物相容性；（3)腫瘤靶向性[16]。針對肝癌的miR-34a替 代療法迫切需要的正是此類功能性基因載體。
[0006] 納米材料的應(yīng)激控釋能力可使載體在某些特定的刺激因素作用下調(diào)控基因藥物 的釋放，腫瘤微環(huán)境中的刺激因素包括pH改變、溫度改變、氧化還原刺激、光刺激等。納米載 體的應(yīng)激敏感性通常與其分子結(jié)構(gòu)的特殊性密切相關(guān)。溫度敏感性常和低臨界溶解溫度 (LCST)下的分子構(gòu)象改變有關(guān)，pH敏感載藥系統(tǒng)多含有酸或堿反應(yīng)性的化學(xué)鍵。氧化還原 敏感性一般通過二硫鍵結(jié)構(gòu)得以實現(xiàn)，載藥系統(tǒng)在外界環(huán)境改變產(chǎn)生氧化還原刺激后，內(nèi) 部二硫鍵逐漸斷裂，系統(tǒng)內(nèi)納米結(jié)構(gòu)被破壞，藥物釋放速率獲得調(diào)控。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)人員一直進行氧化還原敏感型控釋系統(tǒng)的研發(fā):基于具有氧化還原敏感 性的二硫鍵，構(gòu)建了高分子載藥顆粒核心和表面聚乙二醇(PEG)保護殼，載藥并加入核酸 后，帶有負(fù)電的核酸和PEG殼通過靜電作用結(jié)合，壓縮高分子載藥顆粒核心，完成藥物的包 封過程。在溶酶體環(huán)境的還原酶催化下，二硫鍵斷裂導(dǎo)致PEG殼/核酸復(fù)合體自高分子納米 顆粒表面脫落，藥物釋放速率增加。氧化還原敏感性可以保證基因運載系統(tǒng)在腫瘤細胞中 因溶酶體的氧化還原刺激而釋放miRNA，而在系統(tǒng)循環(huán)中幾乎不釋放基因，大大減少了基因 治療的全身毒副作用，并且保證了較高的生物利用度。
[0008] 基因運載靶向性也是目前需要著重解決的問題。國內(nèi)外許多研究人員已在靶向性 上進行了大量的研究，通過多種方法構(gòu)建、篩選了用于基因或藥物運載系統(tǒng)的靶向基團。 CityofHope癌癥中心的MarkDavis教授通過在納米材料上修飾革E1向基團來促進治療革巴 標(biāo)對載藥納米顆粒的吸收和利用，使得載藥系統(tǒng)攜帶的基因能夠特異性地作用于腫瘤細 胞，并首先在體內(nèi)研究中證明了其有效性。
[0009] 精胺及衍生物橋連的環(huán)糊精可形成具有規(guī)整交替結(jié)構(gòu)的聚陽離子納米材料，以聚 陽離子材料為基礎(chǔ)合成了多種高效轉(zhuǎn)染的基因載體，并且進一步通過主客體組裝技術(shù)，對 原始基因載體進行功能化修飾。
[001 0]目前的問題在于，如何進一步改善優(yōu)化載體材料，使其具有高效、靶向的基因藥物 輸送能力，可以實現(xiàn)miR-34a替代療法所需要的多功能性運載，以破解現(xiàn)有miR-34a療法中 的基因運載難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為了解決【背景技術(shù)】中存在的問題，本發(fā)明目的是提供一種基于聚乙烯亞胺-環(huán)糊 精的多功能超分子基因運載系統(tǒng)及其制備方法，可用于新型的非病毒基因治療。本發(fā)明在 含環(huán)糊精的聚陽離子納米材料上，通過主客體組裝技術(shù)修飾含有靶向基團的功能化客體， 并在客體中導(dǎo)入氧化還原敏感的二硫鍵，最終可形成具有氧化還原敏感性、肝癌靶向性、主 客體自組裝的、高效基因轉(zhuǎn)染的多功能基因載體，能夠攜帶治療基因高效治療肝臟惡性腫 瘤。
[0012] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0013] 一、一種基于聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的多功能超分子基因運載系統(tǒng)：
[0014] 主要由主體聚乙烯亞胺-環(huán)糊精以及分別裝載在主體聚乙烯亞胺-環(huán)糊精上的客 體金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇和客體金剛烷-聚乙二醇-靶向肽而形成的復(fù)合物。
[0015] 所述復(fù)合物的具體結(jié)構(gòu)式如下：
[0017] 其中，m、n2、n3分別代表主體聚乙烯亞胺-環(huán)糊精單元個數(shù)、與客體金剛烷-二硫 鍵-聚乙二醇自組裝的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精單元個數(shù)、與客體金剛烷-聚乙二醇-靶向肽自組 裝的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精單元個數(shù)，別代表金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇中聚乙二醇單 元個數(shù)和金剛烷-聚乙二醇-靶向肽中聚乙二醇單元個數(shù)，X1、yi分別代表主體聚乙烯亞胺-環(huán)糊精中伯氨基單元數(shù)量和仲氨基單元數(shù)量，x2、y2分別代表客體金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇 中聚乙烯亞胺的伯氨基單元數(shù)量和仲氨基單元數(shù)量，X3、y3分別代表客體金剛烷-聚乙二醇-革巴向肽中聚乙稀亞胺的伯氨基單元數(shù)量和仲氨基單元數(shù)量;m、n2、n3、mi、m2、xi、X2、X3、yi、 y2、y3均為大于0的整數(shù)。
[0018] 本發(fā)明復(fù)合物所形成分子的分子量大約在10000-20000左右。
[0019] 所述的主體聚乙烯亞胺-環(huán)糊精是由環(huán)糊精與聚乙烯亞胺反應(yīng)得到，所述的客體 金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇是由金剛烷通過二硫鍵與聚乙二醇結(jié)合制備得到。
[0020] 所述的金剛烷-聚乙二醇-靶向肽是由金剛烷甲酸和聚乙二醇反應(yīng)后再結(jié)合靶向 肽制備得到。
[0021] 二、一種基于聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的多功能超分子基因運載系統(tǒng)的制備方法：
[0022] 由環(huán)糊精與聚乙烯亞胺反應(yīng)得到聚乙烯亞胺-環(huán)糊精，由金剛烷通過二硫鍵與聚 乙二醇結(jié)合制備得到金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇，由金剛烷甲酸和聚乙二醇反應(yīng)后再結(jié)合靶 向肽形成金剛烷-聚乙二醇-靶向肽，再將三者按照1:0.5-2:0.5-2