能超分子運(yùn)載系統(tǒng)和核酸形成的納米微 粒經(jīng)二硫蘇糖醇氧化還原刺激后的曲線，4-4是聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和核算形成的納米微粒 經(jīng)二硫蘇糖醇氧化還原刺激后的曲線圖。
[0066]圖5:多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)結(jié)合核酸后形成納米微粒的表面電位及對(duì)氧化還原 刺激的反應(yīng)圖。
[0067]圖中，5-1是多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)和核酸形成的納米微粒曲線，5-2是聚乙烯亞 胺-環(huán)糊精和核算形成的納米微粒曲線，5-3是多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)和核酸形成的納米微 粒經(jīng)二硫蘇糖醇氧化還原刺激后的曲線，5-4是聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和核算形成的納米微粒 經(jīng)二硫蘇糖醇氧化還原刺激后的曲線圖。
[0068]圖6:多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶熒光報(bào)告基因的核酸分子轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后的熒 光強(qiáng)度分布圖。
[0069] 圖中，6-1是生理鹽水處理細(xì)胞曲線，6-2是裸核酸分子處理細(xì)胞曲線，6-3是聚乙 烯亞胺-環(huán)糊精/金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇攜帶核酸處理細(xì)胞曲線，6-4是多功能超分子運(yùn) 載系統(tǒng)攜帶核酸處理細(xì)胞曲線圖。
[0070]圖7:多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶治療基因處理后的細(xì)胞活力曲線圖。
[0071]圖中，a是多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)不攜帶治療基因的曲線，b是裸治療基因曲線，c是聚乙烯亞胺-環(huán)糊精/金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇攜帶治療基因曲線，d是多功能超分子運(yùn) 載系統(tǒng)攜帶治療基因曲線。
[0072]圖8:多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶治療基因處理后的細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯微鏡圖。 [0073]圖中，e是生理鹽水組，f是裸治療基因組，g是多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶治療基 因組。
[0074]圖9:多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶治療基因處理荷瘤裸鼠后的腫瘤生長曲線圖。[0075]圖中，p是生理鹽水組，q是裸治療基因組，r是聚乙烯亞胺-環(huán)糊精/金剛烷-二硫 鍵-聚乙二醇攜帶治療基因組，s是多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶治療基因組。
【具體實(shí)施方式】
[0076]以下結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但不限于實(shí)施例所公開的內(nèi) 容。
[0077]本發(fā)明的實(shí)施例如下：
[0078] 實(shí)施例1:以聚乙烯亞胺-β_環(huán)糊精/(金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇/金剛烷-聚乙二 醇-SP94)為例。
[0079] 1)金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇的合成
[0080] 稱取2克聚乙二醇單甲醚，溶解于30毫升二甲基亞砜中，加入1克Ν，Ν羰基二咪唑 (CDI)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下避光攪拌反應(yīng)3小時(shí)。
[0081]將反應(yīng)液加入至體積為1升的乙醚：四氫呋喃=4:1體積比的混合溶液中，冰浴靜 置2小時(shí)，過濾得到白色粉末。
[0082] 然后將全部白色粉末溶解于20ml二甲基亞砜中；稱取2.24克胱胺二鹽酸鹽溶解于 10毫升二甲基亞砜中，并加入3毫升三乙胺，攪拌1小時(shí)。
[0083]將白色粉末的溶液緩慢滴加至胱胺二鹽酸鹽的溶液中，滴加5小時(shí)，繼續(xù)反應(yīng)3小 時(shí)。反應(yīng)完畢后，溶液在分子量2000透析袋中透析24小時(shí)，然后冰凍干燥，得到白色粉末狀 物質(zhì)備用。
[0084] 稱取180毫克金剛烷甲酸和162毫克⑶I，溶解于20毫升二氯甲烷中，常溫反應(yīng)3小 時(shí)。向其中加入450毫克前述備用白色粉末，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液加 入至體積為200毫升的乙醚：四氫呋喃= 4:1體積比的混合溶液中，冰浴靜置2小時(shí)，過濾得 到白色粉末狀物質(zhì)，即金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇。
[0085] 2)金剛烷-聚乙二醇-SP94的合成
[0086]稱取540毫克聚乙二醇琥珀酰亞胺單酯溶解于20毫升二氯甲烷中，將其緩慢滴加 至70.4毫克金剛烷胺的20毫升二氯甲烷溶液中，常溫?cái)嚢璧渭?小時(shí)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)。 [0087]反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液加入至體積為500毫升的乙醚：四氫呋喃=4:1體積比的混 合溶液中，冰浴靜置2小時(shí)，過濾得到白色粉末狀物質(zhì)，稱取367毫克該化合物，和810毫克 CDI溶解于20毫升二氯甲烷中，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)。
[0088]反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液加入至體積為150毫升的乙醚：四氫呋喃=4:1體積比的混 合溶液中，冰浴靜置2小時(shí)，過濾得到白色粉末狀物質(zhì)。將該白色粉末溶解在10毫升二甲基 亞砜中，將其滴加至92毫克3,3'_二氨基二丙胺的20毫升二甲亞砜溶液中，常溫滴加2小時(shí)， 繼續(xù)攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)。
[0089]反應(yīng)完畢后，將溶液置于分子量2000的透析袋中透析12小時(shí)，然后冰凍干燥，得到 白色粉末狀物質(zhì)，稱取95.8毫克該化合物，溶解于5毫升pH7.4的PBS溶液中，稱取6.25毫克 3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SPDP)溶解于2.5毫升無水乙醇中，將兩溶液 混合，常溫?cái)嚢?小時(shí)。再稱取26.9毫克靶向多肽SP94溶解于2毫升pH7.4的PBS中，加入上述 的反應(yīng)液，常溫反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完畢后，溶液在分子量2000的透析袋中透析12小時(shí)，然后冰 凍干燥，得到白色粉末狀物質(zhì)，即金剛烷-聚乙二醇-SP94。
[0090] 3)聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精的合成
[0091] 稱取1.63克β-環(huán)糊精和0.61克⑶I溶解在10毫升二甲基亞砜中，加入2毫升三乙 胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和避光條件下，常溫?cái)嚢?小時(shí)。
[0092] 稱取2.17克分子量600道爾頓的聚乙烯亞胺溶解在20毫升二甲基亞砜中，將活化 的β-環(huán)糊精的二甲基亞砜溶液緩慢滴加到其中，滴加4小時(shí)，繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)完畢后， 溶液在分子量14000的透析袋中透析12小時(shí)，然后冰凍干燥，得到白色粉末狀物質(zhì)，即聚乙 烯亞胺-β-環(huán)糊精。
[0093] 4)稱取48毫克聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精溶解于10毫升水中，34.2毫克金剛烷-二硫 鍵-聚乙二醇溶解于5毫升水中，5.5毫克金剛烷-聚乙二醇-SP94溶解于5毫升水中，將三者 混合，常溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)完畢后，溶液在分子量14000的透析袋中透析12小時(shí)，然后冰凍 干燥，得到白色粉末狀物質(zhì)，即聚乙烯亞胺-β_環(huán)糊精/(金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇/金剛烷-聚乙二醇-SP94)。
[0094] 實(shí)施例1的SP94、金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇、金剛烷-聚乙二醇-SP94、聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精、聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精/金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇和最終得到的多功能超分子運(yùn) 載系統(tǒng)的核磁共振氫譜如圖1所示，最終產(chǎn)物聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精/(金剛烷-二硫鍵-聚乙 二醇/金剛烷-聚乙二醇-SP94)的核磁共振氫譜表明該化合物為一個(gè)整體，該圖充分證明了 本發(fā)明制備方法的可行性。
[0095] 實(shí)施例1得到的多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)的二維核歐沃豪斯效應(yīng)譜如圖2所示，圖中 橫坐標(biāo)位移1.0-2.0之間的吸收峰為金剛烷的亞甲基氫，縱坐標(biāo)位移3.0-4.0之間的吸收峰 為環(huán)糊精的亞甲基氫，二者之間有遠(yuǎn)程的相關(guān)，表明金剛烷分子是嵌入了環(huán)糊精的環(huán)中，該 圖進(jìn)一步證實(shí)了制備方法的可行性。
[0096] 實(shí)施例1得到的多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)結(jié)合核酸(DNA或RNA)后形成的米微粒如圖 3所示，表明本發(fā)明多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)能夠有效結(jié)合核酸，形成類圓形的納米微粒。
[0097] 實(shí)施例1多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)結(jié)合核酸后形成納米微粒的粒徑和表面電位分別 如圖4和圖5所示，圖中可見，結(jié)合核酸后粒徑約為150納米，表面電位為正;二硫蘇糖醇氧化 還原刺激后多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)的粒徑3較沒有氧化還原刺激的粒徑1更大，而聚乙烯亞 胺-β-環(huán)糊精在氧化還原刺激前2和后4則沒有類似差異；同樣，二硫蘇糖醇氧化還原刺激后 多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)的表面電位7較沒有氧化還原刺激的表面電位5更正，而聚乙烯亞 胺-β_環(huán)糊精在氧化還原刺激前6和后8則沒有類似差異；由此表明本發(fā)明的多功能超分子 運(yùn)載系統(tǒng)具有氧化還原刺激敏感性，可在特殊的氧化還原環(huán)境中控制釋放攜帶的物質(zhì)。
[0098] 實(shí)施例1多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶熒光報(bào)告基因的核酸分子轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后的 熒光強(qiáng)度分布如圖6所示，圖中可見，無論含有靶向肽的多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)12或不含有 靶向肽的聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精/金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇11，其攜帶熒光報(bào)告基因轉(zhuǎn)染腫 瘤細(xì)胞的效率均高于裸熒光報(bào)告基因轉(zhuǎn)染的效率1〇(生理鹽水處理9是陰性對(duì)照組），由此 表明本發(fā)明多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)能夠高效轉(zhuǎn)染基因。
[0099] 實(shí)施例1多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)攜帶治療基因處理肝癌細(xì)胞后的細(xì)胞活力曲線和 劃痕愈合能力試驗(yàn)結(jié)果分別如圖7和圖8。圖中可見，無論含有靶向肽的多功能超分子運(yùn)載 系統(tǒng)d或不含有靶向肽的聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精/金剛烷-二硫鍵-聚乙二醇c，其攜帶治療基 因作用于肝癌細(xì)胞后，均能有效殺傷肝癌細(xì)胞，而生理鹽水處理a和裸治療基因處理b則殺 傷作用弱；多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)g攜帶治療基因作用于肝癌細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞劃痕愈合的抑 制作用顯著強(qiáng)于生理鹽水e和裸治療基因f，由此表明本發(fā)明多功能超分子運(yùn)載系統(tǒng)能夠攜 帶治療基