豬瘟病毒dna/rna雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針 法檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 實時熒光定量PCR在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有廣 泛應(yīng)用，其基本原理為:在PCR反應(yīng)體系中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號強 度，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖，如圖1所 示，在曲線指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可進(jìn)行定 量分析。
[0003]豬痕病毒(Hogcholeravirus，Swinefevervirus)是ssRNA病毒，黃病毒科痕病 毒屬，其RNA為單股正鏈。豬瘟病毒主要危害豬(包括野豬），其他動物不發(fā)病。豬瘟是一種急 性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是高溫、微血管變性而引起全身出血、壞死、梗塞。豬 瘟對豬危害極為嚴(yán)重，會造成養(yǎng)豬業(yè)重大損失。豬瘟病毒兔化疫苗株是使用豬瘟病毒強毒 株反復(fù)感染鈍感動物家兔，通過傳代使其毒力減弱而獲得適應(yīng)兔體的毒株，由此制成的疫 苗。豬瘟病毒兔化疫苗株已被廣泛應(yīng)用于各國的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)，為控制豬瘟起到了重要的作用。 但同時，如何區(qū)分感染豬瘟病毒的豬和接種了兔化疫苗株的豬也成了行業(yè)內(nèi)一大難題。傳 統(tǒng)的豬瘟病毒檢測方法是病毒毒分離培養(yǎng)和ELISA為代表的血清學(xué)的檢測，但在檢測豬瘟 野毒株和疫苗株時，檢測結(jié)果毫無差別?；驒z測可以作為區(qū)分野毒株和疫苗株的方案?，F(xiàn) 今廣泛使用的方案是對豬瘟病毒基因組5 'UTR區(qū)域進(jìn)行序列分析，5 'UTR兔化疫苗株和野毒 株堿基序列分別為：
[0004] 5 'UTR兔化疫苗株:GGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGC;
[0005] 5 'UTR野毒株:GGACTAGCAAACGGAGGGACTAGC;
[0006] 5'UTR兔化疫苗株比野毒株多一個堿基A，在設(shè)計引物對5'UTR區(qū)域進(jìn)行擴增后通 過序列分析可以有效的區(qū)分野毒株和疫苗株。
[0007]現(xiàn)有區(qū)分野毒株和疫苗株豬瘟病毒的方法通常有一下幾種：
[0008] 1 )PCR-測序:設(shè)計引物將豬瘟病毒5 'UTR區(qū)域進(jìn)行PCR擴增，并將產(chǎn)物進(jìn)行測序，從 而區(qū)分；
[0009] 2)PCR-溶解曲線分析:使用熒光染料法（SYBRgreen)對豬瘟病毒5'UTR區(qū)域進(jìn)行 Real-timePCR擴增檢測，實時熒光PCR結(jié)果呈陽性后對產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，根據(jù)解鏈 溫度的不同來區(qū)分野毒株和疫苗株；
[0010] 3)PCR-Taqman探針法:根據(jù)突變區(qū)域，設(shè)計兩條不同標(biāo)記的Taqmen探針，分別和野 毒株、疫苗株完全互補，然后優(yōu)化熒光PCR體系分辨率至足以區(qū)分野毒株和疫苗株。
[0011]然而，PCR-測序法操作步驟繁瑣，成本高，很難作為常規(guī)檢測使用;PCR-溶解曲線 法分辨率低，單堿基突變再溶解曲線結(jié)果上判斷偏主觀，而且對儀器要求較高，市面上大部 分儀器不適用;PCR-Taqman探針法對擴增體系的分辨率優(yōu)化要求較高，且當(dāng)樣本濃度較低 時，對結(jié)果的判斷也偏主觀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于提供一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，旨在解決 現(xiàn)有技術(shù)不能高效、準(zhǔn)確區(qū)分野毒株和疫苗株豬瘟病毒的問題。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法。
[0014]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，包括PCR反 應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括豬瘟病毒5 'UTR引物和DNA/RNA雜合探針；
[0015]所述豬瘟病毒5'UTR引物包括：
[0016]豬瘟病毒5 'UTR上游引物：5 ' -GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3 ' ；
[0017]豬瘟病毒5 'UTR下游引物：5 ' -TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3 ' ；
[0018] 所述DNA/RNA雜合探針包括：
[0019]所述野毒株DNA/RNA雜合探針：5' -AGTCCCTCCGTTTGC-3' ；
[0020]所述疫苗株DNA/RNA雜合探針：5 ' -AGTCCCTCCGTTTTGC-3 '。
[0021]以及，一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法，該方法使用上述豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒進(jìn)行檢測，包括以下步驟：
[0022] 樣本RNA提??；
[0023]RT-PCR-步法檢測；
[0024] 結(jié)果判斷；
[0025]其中，所述實時熒光PCR檢測的參數(shù)設(shè)置為：
[0026] 42-50〇C：10-15min；
[0027] 92-95〇C：2-3min；
[0028]92-95°C:5-10S，55-60°C:40-80S;40 個循環(huán)。
[0029] 本發(fā)明提供的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法，采用特異 性設(shè)計的引物和DNA/RNA雜合探針，使用實時熒光PCR法進(jìn)行檢測，能夠一步同時實現(xiàn)對豬 瘟病毒野毒株和疫苗株的分型檢測。與免疫法豬瘟病毒檢測試劑相比具有可分型檢測，本 發(fā)明具有操作簡單、安全等優(yōu)點，可快速排除疫苗株對檢測結(jié)果的影響。此外，所述試劑檢 測盒與其他分子檢測試劑相比，具有快速、靈敏和方便等優(yōu)點，可應(yīng)用于豬瘟病毒的檢測。
【附圖說明】
[0030]圖1是提供的實時熒光定量PCR擴增曲線示意圖；
[0031]圖2是本發(fā)明實施例提供的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法示意圖；
[0032]圖3是本發(fā)明實施例提供的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法陽性結(jié)果和陰 性結(jié)果不意圖；
[0033]圖4是本發(fā)明實施例1提供的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法擴增圖譜；
[0034]圖5是本發(fā)明對比例1提供的豬瘟病毒熒光PCR法擴增圖譜。
【具體實施方式】
[0035]為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋 本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0036]本發(fā)明實施例中，對下述名詞作出如下解釋。
[0037] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR):是體外酶促合成特異DNA片 段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn) 行，使目的DNA得以迅速擴增。
[0038]實時熒光PCR法:是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān) 測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定性定量分析的方法。
[0039]逆轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT_PCR):是 反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增目的片段。RT-PCR包括兩步：l、mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA; 2、以cDNA為模版進(jìn)行PCR。將這兩個步驟合二為一個反應(yīng)管進(jìn)行即為一步 法，將兩個步驟分開兩管反應(yīng)為兩步法。一步法更方便快捷。
[0040] DNA/RNA雜合探針法是由RNA和DNA構(gòu)成的雜合探針與RNase Η組合使用的高靈敏 度檢出法。DNA/RNA雜合探針內(nèi)部含有RNA堿基、5'端標(biāo)記熒光物質(zhì)、3'端標(biāo)記淬滅物質(zhì)，當(dāng) 探針處于完整狀態(tài)時，由于熒光淬滅作用抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。當(dāng)探針與模板DNA序列完 全匹配后，雜合探針中的RNA堿基與模板形成RNA-DNA復(fù)合體，此時RNase Η在RNA堿基處切 斷探針，淬滅抑制作用解除，熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。此時通過測定熒光強度，能夠?qū)崟r監(jiān)控擴 增產(chǎn)物量。如果探針的RNA部分或與RNA部分相鄰的2~3個堿基與模板不匹配，RNase Η將不 能切斷探針，所以該檢出方法是一種即使有一個堿基不同也能識別的高特異性檢出方法。
[0041] Ct值:每個PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
[0042]本發(fā)明實施例提供了一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng) 液，所述PCR反應(yīng)液包括豬瘟病毒5 'UTR引物和DNA/RNA雜合探針；
[0043]所述豬瘟病毒5'UTR引物包括：
[0044]豬瘟病毒5 'UTR上游引物:5 ' -GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3 '；
[0045]豬瘟病毒5 'UTR下游引物:5 ' -TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3 '；
[0046] 所述DNA/RNA雜合探針包括：
[0047]所述野毒株DNA/RNA雜合探針（CSV-W): 5 '-AGTCCCTCCGTTTGC-3'；
[0048]所述疫苗株DNA/RNA雜合探針（CSV-V):5 '-AGTCCCTCCGTTTTGC-3'。
[0049]本發(fā)明實施例所述試劑盒上述豬瘟病毒5'UTR引物和DNA/RNA雜合探針，是針對豬 瘟病毒5'UTR區(qū)域基因設(shè)計。所述DNA/RNA雜合探針分別為與野毒株和疫苗株互補的DNA/ RNA雜合探針CSV-W和CSV-V。優(yōu)選的，所述DNA/RNA雜合探針采用熒光標(biāo)記物進(jìn)行多色組合 探針編碼標(biāo)記，使所述DNA/RNA雜合探針上標(biāo)記的熒光信號不相同，提高了單一反應(yīng)管中可 識別的探針的數(shù)目，從而提高PCR單管中能夠檢測的靶的數(shù)目。具體的，所述DNA/RNA雜合探 針為采用不同熒光標(biāo)記物進(jìn)行編碼標(biāo)記的DNA/RNA雜合探針，包括：
[0050] 所述野毒株DNA/RNA雜合探針(CSV-W):
[0051] 5 '-FAM-AGTCCCTCCGTTTGC-DABCYL-3'；
[0052] 所述疫苗株DNA/RNA雜合探針(CSV-V):
[0053] 5 '-HEX-AGTCCCTCCGTTTTGC-DABCYL-3'。
[0054]其中，所述野毒株DNA/RNA雜合探針CSV-W由FAM標(biāo)記5 '端，DABCYL標(biāo)記3'端，其堿 基13-T設(shè)計為核糖核酸(RNA);所述疫苗株DNA/RNA雜合探針CSV-V由HEX標(biāo)記5 '端，DABCYL 標(biāo)記3 '端，其堿基14-T設(shè)計為核糖核酸(RNA)。當(dāng)反應(yīng)體系中含有豬瘟病毒野毒株基因RNA 模板的情況下，所述野毒株DNA/RNA雜合探針CSV-W中堿基13-T與模板相應(yīng)位置的A形成 DNA-RNA配對，探針被RnaseH水解從而釋放出熒光信號，并被FAM通道檢測出。當(dāng)反應(yīng)體系中 含有豬瘟病毒疫苗株基因RNA模板的情況下，所述野毒株DNA/RNA雜合探針CSV-W中堿基13-T和所述疫苗株DNA/RNA雜合探針CSV-V中堿基14-T皆與模板相應(yīng)位置的A形成DNA-RNA配 對，由于所述野毒株DNA/RNA雜合探針CSV-W的13-T下游兩個堿基無法配對，所以只有所述 疫苗株DNA/RNA雜合探針CSV-V被RnaseH水解從而釋放出熒光信號。在此體系中，可一步法 實現(xiàn)豬瘟病毒的mRNA逆轉(zhuǎn)錄與cDNA的PCR反應(yīng)，并釋放熒光信號，利用儀器對PCR過程中相 應(yīng)通道的信號強度進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析，對豬瘟病毒進(jìn)行分型 檢測。
[0055] 進(jìn)一步的，本發(fā)明實施例所述PCR反應(yīng)液還包括M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTPs、不 含鎂離子的緩沖液、氯化鎂、溴酚藍(lán)、RnaseH。更進(jìn)一步地，所述試劑盒運用分裝技術(shù)，將所 述溴酚藍(lán)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、RnaseΗ與所述不含鎂離子的緩沖液、氯化鎂、dNTPs、豬 瘟病毒5'UTR引物和DNA/RNA雜合探針采用石蠟隔離，有效保證了DNA聚合酶的活性，延長了 本發(fā)明實施例試劑盒的保存時間。在PCR反應(yīng)過程中，由于溫度在95°C，石蠟熔融，使得上述 反應(yīng)液混合，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行。