r>[0056]本發(fā)明實施例中，所述PCR反應(yīng)液的規(guī)格為8管X 3條，20μ!7管。作為優(yōu)選實施例， 所述PCR反應(yīng)液含有MgCl2、dNTPs、熱啟動(HotStart)Taq酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RnaseH、RNA 酶抑制劑及豬瘟病毒特異性引物和探針。具體的，所述PCR反應(yīng)液的組成如下所述：

[0059] 本發(fā)明實施例豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒是通過熒光強度變化監(jiān)測 產(chǎn)物量的變化，得到一條產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系的熒光擴增曲線 圖，當(dāng)擴增曲線圖Ct值<36,并呈現(xiàn)明顯指數(shù)增長時，結(jié)果表現(xiàn)為陽性；當(dāng)擴增曲線圖Ct值 >38或無Ct值，結(jié)果表現(xiàn)為陰性。因此，為了形成對照，豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試 劑盒設(shè)置陰性對照液和陽性對照液。具體的，所述陽性對照包括豬瘟病毒野毒株和疫苗株 的基因組RNA。更具體的，所述陽性對照使用Tris-EDTA緩沖液對所述豬瘟病毒野毒株和疫 苗株的基因組RNA進行稀釋后冷凍保存，所述Tris-EDTA緩沖液的濃度為0.01mol/L，pH為 8.0,可以用0.6mL普通帶蓋離心管包裝。作為具體實施例，每個試劑盒中設(shè)置40μ!7管的所 述陽性對照1管。所述陰性對照為不含有豬瘟病毒野毒株和疫苗株基因組RNA的Tris-EDTA 緩沖液，所述Tris-EDTA緩沖液的濃度為0.0lmol/L，pH為8.0，可以用0.6mL普通帶蓋離心管 包裝。作為具體實施例，每個試劑盒中設(shè)置40μ!7管的所述陰性對照1管。
[0060] 應(yīng)當(dāng)理解，應(yīng)不同實驗需要，本發(fā)明實施例各組分的規(guī)格可依照上述含量進行調(diào) 整。為了避免操作時取錯組分或?qū)嶒炦^程中由于混淆瓶蓋造成的標(biāo)品交叉污染，本發(fā)明實 施例優(yōu)選采用不同類型和/或顏色的蓋子對不同樣品進行區(qū)分，具體的，所述PCR反應(yīng)液采 用無色透明PCR反應(yīng)管；陰性對照使用紫色透明帶蓋離心管；陽性對照使用橙紅色透明帶蓋 離心管。
[0061] 以及，本發(fā)明實施例還提供了一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法，該方法 使用上述豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒進行檢測，包括以下步驟，如圖2所示：
[0062] SOI.樣本RNA提?。?br>[0063] S02.RT-PCR-步法檢測；
[0064] S03.結(jié)果判斷；
[0065]其中，所述實時熒光PCR檢測的參數(shù)設(shè)置為：
[0066] 42-50〇C：10-15min；
[0067] 92-95〇C：2-3min；
[0068] 92-95°C: 5-10S，55-60°C: 40-80S; 40個循環(huán)。
[0069]具體的，上述步驟SOI中，樣本RNA提取的操作可采用如下方法實現(xiàn)：
[0070] S011.取100yL全血或者血清于1.5mL離心管中，加入500yL Trizol試劑，室溫劇烈 震蕩15秒，靜置5分鐘，再加入120yL氯仿/異戊醇(體積比24:1)，用手劇烈震蕩15秒，室溫靜 置5分鐘。
[0071] S012.12000rpm 4°C離心15分鐘，取上清置于另一新離心管中（切忌吸出中間白色 層）；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。
[0072] S013.12000rpm 4°C離心10分鐘，棄上清，用75%的冰乙醇洗滌沉淀，12000rpm 4 °C離心5分鐘，棄乙醇。
[0073] S014.沉淀室溫干燥除去乙醇，用20-50yL的DEPC-H20溶解沉淀待檢。
[0074] S015.可使用商品化的RNA提取試劑盒。
[0075]當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，也可以采用其他方法進行樣本RNA提取。
[0076]上述步驟S02中，包括取待檢樣本RNA，加入RT-PCR反應(yīng)液，上機檢測。值得注意的 是，每次試驗設(shè)置有陰性對照和陽性對照，否則該次試驗視為無效試驗。本發(fā)明實施例中， 用于豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測的熒光定量PCR儀包括但不限于:ABI系列、Bio-Rad 系列（ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX系列、Roche LightCycler、Cepheid SmartCycler、Corbett Rotor-Gene、杭州博日系列。
[0077]作為優(yōu)選實施例，所述RT-PCR-步法檢測時，對不同的所述DNA/RNA雜合探針采用 熒光標(biāo)記物進行多色組合探針編碼標(biāo)記，使所述豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針上標(biāo)記的熒光 信號不相同。
[0078]上述步驟S03中，根據(jù)檢測的熒光強度結(jié)果進行分析判斷，當(dāng)擴增曲線圖Ct值< 36,并呈現(xiàn)明顯指數(shù)增長時，結(jié)果表現(xiàn)為陽性，如圖3A所示；當(dāng)擴增曲線圖Ct值>38或無Ct 值，結(jié)果表現(xiàn)為陰性，如圖3B所示。本發(fā)明實施例中，通過不同的通道(采用不同熒光基團標(biāo) 記)得到的結(jié)果可進行判定，具體的，當(dāng)采用FAM標(biāo)記野毒株豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針時， 陽性結(jié)果表示樣品中檢測出野毒株豬瘟病毒，而陰性結(jié)果未檢出野毒株豬瘟病毒；當(dāng)采用 HEX標(biāo)記疫苗株豬瘟病毒時，陽性結(jié)果表示樣品中檢測出疫苗株豬瘟病毒，而陰性結(jié)果未檢 出疫苗株豬痕病毒。
[0079]本發(fā)明實施例提供的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法，采 用特異性設(shè)計的引物和DNA/RNA雜合探針，使用實時熒光PCR法進行檢測，能夠一步同時實 現(xiàn)對豬瘟病毒野毒株和疫苗株的分型檢測。與免疫法豬瘟病毒檢測試劑相比具有可分型檢 測，本發(fā)明具有操作簡單、安全等優(yōu)點，可快速排除疫苗株對檢測結(jié)果的影響。此外，所述試 劑檢測盒與其他分子檢測試劑相比，具有快速、靈敏和方便等優(yōu)點，可應(yīng)用于豬瘟病毒的檢 測 。
[0080]下面結(jié)合具體實施例進行說明。
[0081] 實施例1
[0082] 一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液、陰性對照和陽性 對照，其中，所述PCR反應(yīng)液的規(guī)格為:8管X3條，20μ1/管，成分如下表1所示;所述陽性對照 規(guī)格為1管，40μ1/管，成分為豬痕病毒野毒株和疫苗株的基因組RNA，使用Tris-EDTA緩沖液 (0.01MpH8.0)稀釋后冷凍保存;所述陰性對照規(guī)格為1管，40μ1/管，成分為不含有豬瘟病 毒野毒株和疫苗株的基因組RNA的Tris-EDTA緩沖液(0.01ΜρΗ8.0)。
[0083]表1
[0084]
[0085] 一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法，該方法使用上述豬瘟病毒DNA/RNA雜 合探針法檢測試劑盒進行檢測，包括以下步驟：
[0086] SI 1.樣本RNA提取:待檢樣本4例(2例野毒，2例疫苗株）；
[0087]S12.RT-PCR-步法檢測；
[0088]S13.結(jié)果判斷；
[0089]其中，所述實時熒光PCR檢測的參數(shù)設(shè)置為：
[0090] 42-50〇C：10-15min；
[0091] 92-95〇C：2-3min；
[0092] 92-95°C:5-10S，55-60°C:40-80S;40 個循環(huán)。
[0093] PCR擴增圖譜如圖4所示。
[0094] 對比例1
[0095] 待檢樣本4例(2例野毒，2例疫苗株)采用豬瘟病毒核酸檢測試劑(熒光PCR法)進行 對比檢測，操作流程與實施例1相同。PCR擴增圖譜如圖5所示。
[0096] 由圖可見，使用豬瘟病毒(野毒株，疫苗株)DNA/RNA雜合探針法一步法檢測試劑盒 檢測4例樣本皆為陽性，其中2例為FAM通道陽性，可判定為豬瘟病毒野毒株(圖4)，2例為HEX 通道陽性，可判定為豬瘟病毒疫苗株。使用豬瘟病毒核酸檢測試劑（熒光PCR法)檢測4個樣 本皆為陽性，但不能區(qū)分野毒株和疫苗株（圖5)。由此可見，本發(fā)明實施例所述一種豬瘟病 毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法，對區(qū)分野毒株和疫苗株豬瘟病毒具有高 效、準(zhǔn)確的優(yōu)點。
[0097]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液，所述 PCR反應(yīng)液包括豬瘟病毒5 ' UTR引物和DNA/RNA雜合探針； 所述豬瘟病毒5 ' UTR引物包括： 豬瘟病毒5 ' UTR上游引物:5 ' -GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3 ' ； 豬瘟病毒5 ' UTR下游引物:5 ' -TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3 ' ； 所述DNA/RNA雜合探針包括： 所述野毒株DNA/RNA雜合探針：5 ' -AGTCCCTCCGTTTGC-3 ' ； 所述疫苗株DNA/RNA雜合探針：5 ' -AGTCCCTCCGTTTTGC-3 '。2. 如權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，其特征在于，所述 DNA/RNA雜合探針為采用不同熒光標(biāo)記物進行編碼標(biāo)記的DNA/RNA雜合探針，包括： 所述野毒株DNA/RNA雜合探針： 5 '-FAM-AGTCCCTCCGTTTGC-DABCYL-3 '； 所述疫苗株DNA/RNA雜合探針： 5 '-HEX-AGTCCCTCCGTTTTGC-DABCYL-3 '。3. 如權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR 反應(yīng)液還包括M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTPs、不含鎂離子的緩沖液、氯化鎂、溴酚藍、Rnase H〇4. 如權(quán)利要求3所述的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，其特征在于，所述溴 酚藍、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、Rnase Η與所述不含鎂離子的緩沖液、氯化鎂、dNTPs、豬瘟病 毒5 ' UTR引物和DNA/RNA雜合探針采用石蠟隔離。5. 如權(quán)利要求1-4任一所述的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒還包括陽性對照，所述陽性對照包括豬瘟病毒野毒株和疫苗株的基因組RNA。6. 如權(quán)利要求1-4任一所述的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒還包括陰性對照，所述陰性對照為不含有豬瘟病毒野毒株和疫苗株基因組RNA 的Tris-EDTA緩沖液。7. 如權(quán)利要求1-4任一所述的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，其特征在于， 所述PCR反應(yīng)液的組成如下所述：8. -種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法，其特征在于，該方法使用如權(quán)利要求1-7任一項所述豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒進行檢測，包括以下步驟： 樣本RNA提取； RT-PCR-步法檢測； 結(jié)果判斷； 其中，所述實時熒光PCR檢測的參數(shù)設(shè)置為： 42-50〇C：10-15min； 92-95〇C：2-3min； 92-95°C: 5-10S，55-60°C: 40-80S; 40 個循環(huán)。9. 如權(quán)利要求8所述的豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法，其特征在于，所述RT-PCR-步法檢測時，對不同的所述DNA/RNA雜合探針采用熒光標(biāo)記物進行多色組合探針編碼 標(biāo)記，使所述豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針上標(biāo)記的熒光信號不相同。
【專利摘要】本發(fā)明適用于病毒檢測試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法。該試劑盒包括豬瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA雜合探針，該檢測方法使用實時熒光PCR法進行檢測。本發(fā)明豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法與現(xiàn)有技術(shù)比較，能夠一步同時實現(xiàn)對豬瘟病毒野毒株和疫苗株的分型檢測，且具有靈敏度高、特異性強、周期短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/70
【公開號】CN105463133
【申請?zhí)枴緾N201511000451
【發(fā)明人】田仁鵬, 吳成貢, 王茵茵, 鄧春興
【申請人】深圳市生科源技術(shù)有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月28日