用于使衍生自多能哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的心肌細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明通常涉及細(xì)胞培養(yǎng)和干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及衍生多 能胚胎干細(xì)胞(PESC)的胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞的成熟。尤其是，本發(fā)明提供了用于在 體外從哺乳動(dòng)物PESC衍生的胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞產(chǎn)生成體樣心肌細(xì)胞的化學(xué)上定 義的組合物和方法。在本發(fā)明的一些方面，提供了使用本發(fā)明化學(xué)上定義的組合物在體外 從衍生自哺乳動(dòng)物PESC的胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞產(chǎn)生成體樣心肌細(xì)胞的方法?；瘜W(xué)上 定義的培養(yǎng)基組合物、產(chǎn)生的成體樣心肌細(xì)胞，和本發(fā)明的方法可應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)、藥物引 起的心臟毒性試驗(yàn)、預(yù)測毒理學(xué)篩選試驗(yàn)、候選藥物的臨床前篩選、心血管研究和心臟疾病 模擬、再生醫(yī)學(xué)和其它旨在模擬或治療成人心臟疾病的應(yīng)用的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 醫(yī)學(xué)多個(gè)領(lǐng)域(即心理健康，心臟病，免疫等等)需要新的和更有效的藥物，這些領(lǐng) 域的進(jìn)展被在藥物開發(fā)途徑中與多個(gè)候選先導(dǎo)化合物相關(guān)的不希望的藥物引起的不良反 應(yīng)所造成的極端成本所嚴(yán)重地阻礙。對于所有的藥物開發(fā)而言，當(dāng)前藥物開發(fā)過程的主要 弊端是，由無法預(yù)料的藥物不良反應(yīng)，尤其是心臟毒性反應(yīng)引起的先導(dǎo)化合物的高消耗率 經(jīng)常在藥物開發(fā)途徑的后期階段而不是早期階段被發(fā)現(xiàn)。藥物引起的心臟毒性的預(yù)防，其 可自身表現(xiàn)為心律失常，代表了管理機(jī)關(guān)和(生物）制藥公司的當(dāng)務(wù)之急，因?yàn)檫@種類型毒 性的表現(xiàn)是直接危及生命的。已表明，在臨床研究中33%的不利安全事故通常是歸因于心 臟的心律失常影響，其可導(dǎo)致個(gè)體突然死亡或嚴(yán)重的心臟并發(fā)癥（Mordwinkin et al (2013)Journal of cardiovascular translational research,Vol:6(I):22-30)〇
[0003] 因此，迫切需要新的符合成本效益的策略來提高藥物開發(fā)/發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)方法，例如 消除藥物引起的心臟毒性反應(yīng)。尤其是，在藥物途徑開發(fā)中迫切需要在早期階段預(yù)測藥物 引起的心臟毒性，但這一需要未得到滿足。在過去的十年間，大量的研究工作致力于實(shí)現(xiàn)這 個(gè)目標(biāo)。例如，已經(jīng)開發(fā)多個(gè)生物模型和工具，包括多能干細(xì)胞、離子通道分析和計(jì)算工具 的使用。尤其是，在開發(fā)創(chuàng)新預(yù)測分析以改正藥物開發(fā)期間心臟毒性相關(guān)問題中，衍生自多 能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的使用是目前關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0004] 多能干細(xì)胞，例如多能胚胎干細(xì)胞(PESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)，是用于在體 外培養(yǎng)中產(chǎn)生心肌細(xì)胞的細(xì)胞潛在來源。心肌細(xì)胞的使用不僅對開發(fā)用于預(yù)測所有開發(fā)中 的藥物的藥物引起的毒性的分析是重要的，而且通常對于心臟的研究以及對新的心臟藥物 的開發(fā)也是重要的，其中，心肌細(xì)胞可用于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)和評估心臟藥物安全性。在體 外從PESC和/或iPSC產(chǎn)生心肌細(xì)胞的能力也開創(chuàng)了其它治療途徑，例如再生醫(yī)學(xué)，其中，例 如，PESC和/或iPSC衍生的心肌細(xì)胞可用于直接修復(fù)需要它們的病人的受損的心臟組織。
[0005] 在藥物開發(fā)/發(fā)現(xiàn)、藥物安全性分析、心臟疾病模擬、心臟研究、再生醫(yī)學(xué)和其它生 物目的中使用心肌細(xì)胞的能力，主要取決于培養(yǎng)和獲得衍生自體外培養(yǎng)的PESC和/SiPSC 的心肌細(xì)胞的能力，這些心肌細(xì)胞必須滿足某些表型要求，例如，一定水平的功能特性(例 如成體樣電生理模式)和/或遺傳圖譜(例如細(xì)胞命運(yùn)特異性(fate-specific)遺傳標(biāo)記的 成體樣表達(dá)），和/或形態(tài)學(xué)方面(如成體樣形狀和組織學(xué)特性）。
[0006] 在這方面，本領(lǐng)域的主要局限是用于從體外培養(yǎng)的PESC和/或iPSC產(chǎn)生心肌細(xì)胞 的當(dāng)前方法和培養(yǎng)基組合物產(chǎn)生的結(jié)果，這些結(jié)果是次優(yōu)的和不匹配或只部分匹配應(yīng)用 (例如藥物開/發(fā)現(xiàn)、藥物安全性分析、心臟疾病模擬、心臟研究、再生醫(yī)學(xué)）的需要，這些應(yīng) 用中需要適合于"現(xiàn)實(shí)"環(huán)境（即成體樣狀態(tài)）的心肌細(xì)胞。這是因?yàn)楫?dāng)前的方法和培養(yǎng)基組 合物產(chǎn)生不成熟的心肌細(xì)胞，其類似于胎兒的（胎兒樣）心肌細(xì)胞。這樣的心肌細(xì)胞不適合 用于諸如藥物開發(fā)/發(fā)現(xiàn)、藥物安全性分析，心臟疾病模擬、心臟研究、再生醫(yī)學(xué)和其它旨在 模擬或治療通常在成人期而不在早期發(fā)育階段發(fā)生的心臟疾病的目的應(yīng)用中。因此，成體 樣(成熟的）心肌細(xì)胞比不成熟的心肌細(xì)胞或胎兒樣心肌細(xì)胞更適合這些目的。
[0007] 因此，需要改進(jìn)的方法和培養(yǎng)基組合物用于從體外培養(yǎng)的PESC和/或iPSC產(chǎn)生成 體樣心肌細(xì)胞(而不是不成熟的心肌細(xì)胞）。也需要改進(jìn)的方法和培養(yǎng)基組合物以產(chǎn)生更大 量的(更大的產(chǎn)量)衍生自胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞的成體樣心肌細(xì)胞，在體外干細(xì)胞分 化的中，它們本身衍生自PESC和/或iPSC。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過提供促進(jìn)本身衍生自體外培養(yǎng)的多能胚胎干細(xì)胞的胎兒樣 (不成熟的）心肌細(xì)胞成熟的化學(xué)上定義的培養(yǎng)基組合物，和用于在體外培養(yǎng)中產(chǎn)生所述成 體樣心肌細(xì)胞的方法，以克服本領(lǐng)域的主要限制，該方法更有效率而且支持滿足心臟研究 和臨床應(yīng)用的總體要求的成體樣心肌細(xì)胞的更大規(guī)模生產(chǎn)。
[0009] 發(fā)明詳述
[0010] 一般定義
[0011] 在下面的描述和實(shí)施例中使用了一些術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書，包 括這些術(shù)語給定的范圍的清楚和一致的理解，提供了下面的定義。除非本文另外定義，使用 的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。所有 出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用的方式整體并入本文。
[0012] 本文使用的術(shù)語"干細(xì)胞"指的是通過它們在單個(gè)細(xì)胞水平自我更新和分化產(chǎn)生 子代細(xì)胞的能力來定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新的祖細(xì)胞、非自我更新的祖細(xì)胞和末 端分化細(xì)胞。干細(xì)胞具有在培養(yǎng)時(shí)無限期分裂的能力。干細(xì)胞的特點(diǎn)也在于它們在體外從 多胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成不同細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞的能力，以及在移植后 產(chǎn)生多胚層組織的能力和在注射入囊胚后顯著有助于大部分(如果不是所有)組織的能力。 干細(xì)胞分類為成體(somatic)(成體(adult))干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。成體干細(xì)胞是在分化組 織中發(fā)現(xiàn)的未分化細(xì)胞，可自我更新(克隆)和(有一定的限制)分化以獲得它所起源的組織 的所有特定細(xì)胞類型。
[0013]本文使用的術(shù)語"胚胎干細(xì)胞"，在本領(lǐng)域中也縮寫為"ES細(xì)胞"或ESC(或如果是人 源的，則為'hES細(xì)胞'或'hESCs細(xì)胞'）是技術(shù)人員通常理解的，并且指的是衍生自囊胚的內(nèi) 細(xì)胞團(tuán)的多能胚胎干細(xì)胞(PESC)。技術(shù)人員理解如何獲得這樣的胚胎干細(xì)胞，例如Chung所 描述的（Chung et al(2008)Stem Cell Lines,Vol 2(2): 113-117)，其采用不引起供體胚 胎破壞的技術(shù)。
[0014]本文使用的術(shù)語"多能性"是技術(shù)人員通常理解的，并且指的是具有分化為組成一 種或多種組織或器官的所有細(xì)胞潛能的多能干細(xì)胞的屬性，例如，三個(gè)胚層中的任何一個(gè)： 內(nèi)胚層（例如，內(nèi)部的胃黏膜，胃腸道，肺），中胚層（例如心臟，肌肉，骨頭，血液，泌尿生殖 道），或外胚層(例如表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng)）。
[0015] 本文使用的術(shù)語"多能胚胎干細(xì)胞"，縮寫為"PESC"，指的是衍生自早期胚胎的多 能干細(xì)胞。PESC可分化為衍生自三個(gè)胚層中的任何一個(gè)胚層的細(xì)胞?？赏ㄟ^標(biāo)記或譜系特 異性標(biāo)記的使用(包括但不限于0ct-4、Nanog、GCTM-2、SSEA3和SSEA4)區(qū)別PESC與其它類型 的細(xì)胞。
[0016] 本文使用的術(shù)語"誘導(dǎo)多能干細(xì)胞"，通常縮寫為iPSC，指的是通過被迫表達(dá)對保 持胚胎干細(xì)胞的"干性（sternness)"重要的因子而重編程以進(jìn)入胚胎干細(xì)胞樣狀態(tài)的成體 (成體)細(xì)胞。通常，iPSC通過以下方式由非多能性細(xì)胞(如成人體細(xì)胞，或末端分化細(xì)胞）， 例如纖維原細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元、表皮細(xì)胞等人工制備，即通過將所述非多能性 細(xì)胞引入重編程因子，或使所述非多能性細(xì)胞與所述重編程因子接觸。術(shù)語"誘導(dǎo)多能干細(xì) 胞(iPSC)"不包括胚胎干細(xì)胞。
[0017] 本文使用的術(shù)語"甲狀腺激素樣化合物"指的是甲狀腺激素(也稱為三碘甲狀腺氨 酸(T3))，以及類似于甲狀腺激素 T3或模仿甲狀腺激素 T3行為的化合物。甲狀腺激素樣化合 物的非限制性實(shí)例包括甲狀腺激素受體激動(dòng)劑化合物如DIPA(也稱為3,5_二碘甲狀腺丙酸 或DITPA)、GC_1化合物（其是來自Bristol-Myers Squibb的甲狀腺激素受體亞型β(ΤΙ?β))選 擇性激動(dòng)劑）、R〇化合物(其來自Roche Pharmaceuticals的甲狀腺激素受體亞型β? (TRP)) 選擇性激動(dòng)劑）、C023化合物(其是來自KaroBio的甲狀腺激素受體亞型a I (TRa 1)選擇性激 動(dòng)劑）、KB2115(其是來自KaroBio的甲狀腺激素受體亞型β(ΤΗβ)選擇性激動(dòng)劑）。
[0018] 在本發(fā)明中，本文使用的術(shù)語"增殖（P r 〇 I i f e r a t i ο η ) "或"倍增 (multiplication)"或"擴(kuò)增(expans ion)"指的是生物過程，其中體外培養(yǎng)時(shí)，在控制條件 下，在指數(shù)過程中一個(gè)PESC或一個(gè)iPSC("母細(xì)胞"）生長和分裂，產(chǎn)生兩個(gè)PESC或兩個(gè)iPSC 細(xì)胞（"子細(xì)胞"）等。在PESC或iPSC增殖或擴(kuò)增或倍增的過程中，可以理解的是PESCSiPSC 正自我更新。細(xì)胞的自我更新是給定的細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞分裂的多個(gè)周期，同時(shí)保持未分化狀 態(tài)的能力。
[0019] 在本發(fā)明中，本文使用的術(shù)語"分化"指的是在體外培養(yǎng)時(shí)，在控制條件下，通過非 特化的PESC或iPSC獲得特化細(xì)胞(例如的心臟細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞）、肝細(xì)胞或肌細(xì)胞)的生 物過程。分化受細(xì)胞基因與細(xì)胞外的物理和化學(xué)條件的相互作用的控制，通常經(jīng)由涉及嵌 入細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的信號通路。在某些實(shí)施方案中，多能干細(xì)胞(例如PESC或iPSC)可暴 露于本發(fā)明的培養(yǎng)基組合物和方法，以便促進(jìn)多能干細(xì)胞分化為胎兒樣心肌細(xì)胞。心臟分 化(cardiac differentiation)可通過使用標(biāo)記(選自，但不限于NKX2_5、GATA4、肌球蛋白 重鏈、肌球蛋白輕鏈、α-輔肌動(dòng)蛋白、肌f丐蛋白和原肌球蛋白）來檢測（Burridge et al (2012)Stem Cell Cell,V〇1.10(1):16-28，US2013/0029368)〇
[0020] 技術(shù)人員知道獲得干細(xì)胞(例如PESC-和/或iPSC)衍生的心肌細(xì)胞的多種方法。當(dāng) 干細(xì)胞從分化抑制的條件中移除和/或在稱為擬胚體的懸浮聚合物（S u S p e n S i ο η aggregates)中生長時(shí)，自發(fā)分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞。心肌細(xì)胞起源于中胚層，因此干細(xì)胞 分化為心肌細(xì)胞需要向中胚層細(xì)胞譜系有效的分化。心臟譜系的這種定向分化主要通過多 種策略實(shí)現(xiàn)，包括在已知的影響心臟發(fā)育的生長因子和抑制劑的存在下擬胚體的形成(參 見，例如Kehat et al. ,Clin. Invest. 2001; 108,407-414)、對在胚胎形成過程中內(nèi)胚層對 心臟分化的影響的依賴(Mummery et al，，Circulation.2003; 107,2733-2740)，例如，通過 共培養(yǎng)干細(xì)胞與小鼠 END-2獲得干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞，或通過使用接種于基質(zhì)膠 (Matrigel))、同時(shí)用激活素 A和BMP4相繼處理的的高密度干細(xì)胞的單層培養(yǎng)(Laflamme et al·2007;Nat.Biotechnol·25，1015-1024)。
[0021] 本文使用的術(shù)語"未分化的"指的是未發(fā)展更特化細(xì)胞的特性的PESC和/或iPSC。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，術(shù)語"未分化的"和"分化的"彼此是相對的。"分化的" PESC和/或 PSC具有更特化細(xì)胞的特性。分化的細(xì)胞和未分化的細(xì)胞彼此通過多個(gè)完善的標(biāo)準(zhǔn)相區(qū)別， 所述標(biāo)準(zhǔn)包括形態(tài)特性例如相對大小和形狀、核體積與細(xì)胞質(zhì)體積的比值，和表達(dá)特性，如 可檢測到存在分化的已知(基因）標(biāo)記。
[0022] 在本發(fā)明中，本文使用的術(shù)語"成熟"指的是生物過程，其中需要衍生自表現(xiàn)不成 熟發(fā)育狀態(tài)(或胎兒狀態(tài)）的PESC或iPSC的分化細(xì)胞，以在體外培養(yǎng)時(shí)，在控制條件下獲得 更具功能性或全功能性的（包括基因的和形態(tài)的）發(fā)育狀態(tài)。因此，PESC-和/或iPSC衍生的 胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞的成熟，可能伴隨有胎兒基因/蛋白質(zhì)表達(dá)、胎兒形態(tài)特征和相 關(guān)的功能特性的損失，和與成體(或成體樣)細(xì)胞或成熟細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)、形態(tài)特征和 功能特性的獲得。使PESC衍生的和/或iPSC衍生的胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞"成熟"的過 程導(dǎo)致PESC-和/或iPSC衍生的心肌細(xì)胞具有更成體樣或更成熟的發(fā)育狀態(tài)。
[0023] 本文使用的術(shù)語"心肌細(xì)胞（card i omyo cy t e s )"或"心肌細(xì)胞（card i ac myocytes)"通常指的是任何心肌細(xì)胞譜系細(xì)胞，并且，除非另有說明，可適用于處于心肌細(xì) 胞個(gè)體發(fā)育的任何階段的細(xì)胞。例如，心肌細(xì)胞可同時(shí)包括心肌細(xì)胞前體細(xì)胞(不成熟的心 肌細(xì)胞或胎兒心肌細(xì)胞)和成熟的心肌細(xì)胞(成體樣心肌細(xì)胞）。進(jìn)一步的，心肌細(xì)胞可被細(xì) 分成亞型包括，但不限于，竇房心肌細(xì)胞、心室心肌細(xì)胞、竇房結(jié)(SA)節(jié)點(diǎn)心肌細(xì)胞、外圍SA 節(jié)點(diǎn)心肌細(xì)胞或中央SA節(jié)點(diǎn)心肌細(xì)胞。
[0024] 本文使用的術(shù)語"胎兒樣心肌細(xì)胞"或"不成熟的心肌細(xì)胞"指衍生自體外培養(yǎng) PESC和/或iPSC的心肌細(xì)胞，其不具有有關(guān)成體或成體樣心肌細(xì)胞的所需表型和/或基因 型。例如，這樣的胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞可展示自動(dòng)性（自發(fā)性收縮)和/或胎兒型離子 通道表達(dá)，和/或胎兒型電生理信號，和/或胎兒樣基因表達(dá)模式，和/或胎兒型生理表型。胎 兒樣（不成熟的）心肌細(xì)胞可以，例如，通過使用標(biāo)記或譜系特異性標(biāo)記（包括，但不限于， MYH6、TNNT2、TNNI3、MLC2V、EMILIN2、SIRPA、VECAM，和其它適合于評價(jià)胎兒或胎兒樣發(fā)育階 段的標(biāo)記）區(qū)別于其它細(xì)胞類型(Burridge et al.^OOStem Cell Cell,VoLlO(I) zie-SS)。新陳代謝的成熟可通過技術(shù)人員已知的方法確定，例如檢查這些細(xì)胞的表型、形態(tài)學(xué)、 基因表達(dá)、新陳代謝標(biāo)記、細(xì)胞表面標(biāo)記、電生理特性和/或細(xì)胞功能分析的方法。例如，對 于成熟者可測定與"胎兒"狀態(tài)或心臟肥大狀態(tài)(hypertrophyic state)(例如，NPPA(BNA)) 和NPI3B(BNP))相關(guān)的基因的低表達(dá)，或優(yōu)選地，測定成熟干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的電生理 特性，其中對于更成熟的干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞，可以看到更成體或更成體樣心肌細(xì)胞的 特性，如本文中詳細(xì)討論的。
[0025] 此外，干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的相對成熟，可通過與胎兒狀態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)降 低的存在來測定，例如NPPA、NPPB、平滑肌肌動(dòng)蛋白和骨骼肌動(dòng)蛋白，或通過成體基因/蛋白 質(zhì)表達(dá)增加來測定，如肌球蛋白輕鏈2V肌集鈣蛋白和魚尼丁受體。
[0026] 本文使用的術(shù)語"成體樣心肌細(xì)胞"或"成熟的心肌細(xì)胞"指的是具有有關(guān)成體心 肌細(xì)胞的所需表型和/或基因型的心肌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，成熟的細(xì)胞有以下細(xì)胞的 表型和/或基因型：成體心肌細(xì)胞或心房心肌細(xì)胞或心室心肌細(xì)胞或SA節(jié)點(diǎn)心肌細(xì)胞或外 圍SA節(jié)點(diǎn)心肌細(xì)胞或中央SA節(jié)點(diǎn)心肌細(xì)胞，但不限于此。在其他實(shí)施方案中，與衍生自體外 培養(yǎng)的PESC和/或iPSC的胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞相比，"成體樣心肌細(xì)胞"或"成熟的心 肌細(xì)胞"展現(xiàn)出更成熟的電生理學(xué)模式和/或更成熟的鈣處理模式，和/或更成體型離子通 道表達(dá)，和/或更成體型電生理信號，和/或更成體樣收縮性能，和/或更成體樣基因表達(dá)模 式，和/或更成體型生理(形態(tài))表型。成體樣心肌細(xì)胞也可包含更大程度的肌原纖維組織和 肌節(jié)紋理(sarcomeric striations)，其特點(diǎn)是在衍生自體外培養(yǎng)的PESC和/或iPSC的胎兒 樣(不成熟的）心肌細(xì)胞中發(fā)育不良或不充分。
[0027]技術(shù)人員知道如何評價(jià)體外培養(yǎng)的PESC和/或iPSC衍生的心肌細(xì)胞的成熟，例如 通過使用與特定的發(fā)育階段相關(guān)的已知的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記或譜系特異性標(biāo)記以及本 領(lǐng)域可用的方法，從而區(qū)分成體樣(成熟的）心肌細(xì)胞和胎兒樣(不成熟的）心肌細(xì)胞。在本 發(fā)明中，評價(jià)體外培養(yǎng)的PESC和/或iPSC衍生的心肌細(xì)胞的成熟的方法是，評價(jià)與胎兒(不 成熟的）狀態(tài)(例如但不限于NPPA、NPPB、平滑肌肌動(dòng)蛋白和骨骼肌動(dòng)蛋白）相關(guān)的基因標(biāo)記 的表達(dá)。一個(gè)或多個(gè)所述胎兒(不成熟的)標(biāo)記(基因）的表達(dá)降低會(huì)指示成體樣(成熟的)狀 態(tài)。另一種評價(jià)體外培養(yǎng)的PESC衍生的和/或iPSC衍生的心肌細(xì)胞成熟的方法是，評價(jià)與成 體樣(成熟的）狀態(tài)（例如，（但不限于)肌球蛋白輕鏈2V、肌集鈣蛋白和魚尼丁受體)相關(guān)的 基因標(biāo)記的表達(dá)。一種或多種所述成體樣（成熟的）標(biāo)記(基因）表達(dá)的增加會(huì)指示成體樣 (成熟的）狀態(tài)（Burridge et al·，（2012) ,Stem Cell Cell，Vol .10(1) :16-28) 〇
[0028] 另一種評價(jià)體外培養(yǎng)的PESC和/或iPSC衍生的心肌細(xì)胞成熟的方法是評價(jià)它們的 電生理特性，例如，細(xì)胞在體外產(chǎn)生和/或傳播動(dòng)作電位的能力。體外培養(yǎng)的PESC和/SiPSC 衍生的心肌細(xì)胞的電生理的成熟，可以例如通過膜片鉗技術(shù)以及其它技術(shù)評價(jià)。與胎兒樣 (不成熟的）電生理表型相比，指示成體樣(成熟的）電生理表型的變化，包括(但不限于），最 大上升速率增加、靜止膜電位降低和動(dòng)作電位的振幅增強(qiáng)，這些都是成體心肌細(xì)胞的印記。
[0029] 另一種評價(jià)體外培養(yǎng)的PESC和/或iPSC衍生的心肌細(xì)胞成熟的方法是，評價(jià)它們 的代謝型(metabolic profile)，例如，在體外培養(yǎng)中線粒體的活性。體外培養(yǎng)的PESC和/或 iPSC衍生的心肌細(xì)胞代謝型的成熟可以，例如通過使用TMRM分析(除了別的技術(shù)外)進(jìn)行評 價(jià)，TMRM分析利用電位紅色焚光染料四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl es ter )，俗稱TMRM。用TMRM處理導(dǎo)致在健康運(yùn)行的線粒體的內(nèi)膜區(qū)域中由線粒體膜電位驅(qū) 動(dòng)的TMRM積累。與胎兒樣(不成熟的）代謝型相比較，指示成體樣（成熟的）代謝型的特征性 變化的非限制性實(shí)例，?是TMRM在衍生自胎兒樣(