mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)混合，然后在室溫下溫育2小時。接 著，將MOR-納米粒子綴合物用磷酸鹽緩沖溶液(5mM，pH 7.5)洗滌5次并離心以除去未反應(yīng) 的MORs。所述綴合物可直接用作納米探針或儲存在4°C冷藏機中直至使用。當在4°C下儲存 時，納米探針穩(wěn)定至少6個月。使用前，需要通過渦旋使納米探針溶液均勻分散。 基因組DNA(gDNA)提取
[0083] 從培養(yǎng)的細胞中提取gDNA是根據(jù)制造商的說明使用Wizard? SV基因組DNA純化系 統(tǒng)（Promega)來進行。通過使用Nanodrop 1000(Thermo Scientific)測量吸光度來檢查 gDNA樣品的數(shù)量(ng/μL)和質(zhì)量(A260/A280比率）。對于MCF-7和MADMB-231gDNA樣品，260nm 和280nm處的吸光度比率(A260/A280比率)分別為1.78和1.81。
[0084]在華法林基因分型研究中，從人臉頰拭子的gDNA提取是根據(jù)制造商的說明使用以 下商業(yè)試劑盒來進行：Wlzard? SV基因組DNA純化系統(tǒng)（Promega)、Gentra Puregene DNA提 取試劑盒(Qiagen)或QIAamp DNA Investigator試劑盒(Qiagen)。樣品的A260/A280比率從 1.62至1.95變化。 PCR
[0085]通過使用SEQ ID No. 1-6所示的引物來進行用于擴增包含p53基因的外顯子8中的 密碼子280的靶序列的PCR。最終體積為25yL的溶液包含~IOng gDNA、12.5yL Fermentas主 混合物(2 X )和ΙμΜ各引物。對于野生型DNA背景中的突變檢測，將PCR混合物中的gDNA總量 增加至IOOng，使得低水平突變型模板的數(shù)量對于擴增而言是足夠的。PCR循環(huán)在？!^-200DNA Engine(Bio-Rad)上根據(jù)以下條件進行:一個循環(huán)，95°C下2分鐘;40個循環(huán)，95°C下 20秒、55°C下30秒以及72°C下30秒。通過在含有SafeView的1.5 %瓊脂糖凝膠上運行5yL PCR產(chǎn)物的等分試樣來驗證PCR產(chǎn)生319-bp擴增子的成功性。為產(chǎn)生ssDNA靶，采用λ-核酸外 切酶消化策略（Higuchi ,RG和Ochman，H(1989)Nucleic Acids Res ,17,5865-5865KPCR中 使用磷酸標記的反向引物。將20yL PCR產(chǎn)物與10單位的λ-核酸外切酶(Fermentas)-起溫 育10分鐘，然后使酶在80°C下失活10分鐘。 aPCR(不對稱聚合酶鏈反應(yīng)）
[0086] 在華法林敏感性試驗試劑盒中，使用aPCR來產(chǎn)生ssDNA靶。最終體積為25yL的PCR 溶液包含~IOng gDNA、12 · 5yL主混合物(Fermentas或Promega，2 X )、ΙμΜ正向引物和IOOnm 反向引物。PCR循環(huán)在PTC-200DNA Engine(Bio-Rad)上進行(循環(huán)參數(shù)在圖16中示出）。通過 在用SafeViewTM染料染色的1.5%瓊脂糖凝膠上運行5yL PCR產(chǎn)物的等分試樣來驗證PCR產(chǎn) 生特定大小的擴增子的成功性。 Tm測量
[0087]將合成靶或ssDNA擴增子分別與特定的WT和MUT納米探針混合。接著，用熱循環(huán)儀 測量靶探針雜交體的Tm值。使溫度以1.0°C的間隔從30°C增加。在每一溫度下，在顏色可視 化或用照相機記錄之前使溶液溫育1分鐘。當觀察到從紅色到淡灰色的清楚色變時，將溫度 記錄為Tm。 基因型指定
[0088]將通過合成DNA靶獲得的（TmWT_TmMUT)散點圖（圖5和圖12分別針對p53和華法林 檢驗）用作標準基因分型圖。實驗數(shù)據(jù)點(TmWT，TmMUT)繪制在特定的圖中，并且其位置用于 測定樣品的基因型。通常沿著三個基因型區(qū)域中的一個來對數(shù)據(jù)點進行分組。數(shù)據(jù)點位于 WT標準區(qū)域下方的樣品應(yīng)被指定為WT，而數(shù)據(jù)點位于MUT標準區(qū)域上方的樣品應(yīng)被指定為 MUT0 體細胞突變測定
[0089] 根據(jù)圖5，TmWT的值用于確定TmMUT的下限（即，TmMUT_WT，針對100%的WT靶獲得的 值）。如果TmMUT的測量值比下限高U 2°C)，則樣品應(yīng)被指定為體細胞突變。 實施例1:ρ53基因的分析
[0090] 為了證實雙納米探針基因分型方法，對來自兩種人細胞系MCF-7和MDA-MB-231的 基因組DNA(gDNA)進行提取并分析，以確定p53基因、密碼子280的突變狀態(tài)。p53基因被稱為 編碼P53蛋白質(zhì)的腫瘤抑制基因，其抑制腫瘤的發(fā)展和生長?；虻耐蛔冊诟鞣N類型的人類 癌癥中是常見的（Hollstein，M等人，（1992)Science，253,49-53)。密碼子280G>A純合突變 發(fā)生于人乳腺癌細胞系MDA-MB-231中，而細胞系MCF-7的p53基因為野生型（Bartek，J (1990)0ncogene,5,893-899)〇
[0091] 用于制備WT和MUT納米探針的MOR序列由SEQ ID No. 1-6示出。WT和MUT納米探針兩 者均穩(wěn)定分散在5mM磷酸鹽緩沖溶液(pH~7.5)中。當將50mM NaCl加入納米探針溶液中時 觀察到清楚的色變。該特征與先前所報道的類似，盡管MOR序列是不同的(Zu，Y等人，（2011) Small,7,306-310)〇
[0092] 使用合成101-核苷酸單鏈DNA(ssDNA)靶來研究納米探針在序列區(qū)分方面的能力。 靶分別由P53基因區(qū)段的WT和MUT序列表示。G>A的單堿基變異位于序列的中間位點。在2 2nm的WT或MUT靶的存在下，WT和MUT納米探針均得以穩(wěn)定并且在與50mM NaCl-起溫育后未 觀察到色變。通過增加溫度，基于溶液顏色的變化來獲得納米探針-靶雜交體的1^值。圖4示 出作為靶數(shù)量的函數(shù)的T m值。在每種給定靶濃度下，單堿基錯配導(dǎo)致WT和MUT探針的Tm差異； Δ Tm WT和Δ Tm MUT從10°C至12°C變化。納米探針對(通過以1:1比率混合WT和MUT靶獲得的） 雜合樣品的響應(yīng)在圖4中示出。
[0093] WT、MUT和WT/MUT=1:1(表示雜合基因型）靶的（TmwMmMUT)的散點圖在圖5中示 出。當靶濃度在5nm至500nm的相對寬范圍上變化時，與3類靶序列對應(yīng)的3個數(shù)據(jù)點組在沿 著它們的特定線性區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，并且彼此明顯區(qū)分。這些結(jié)果證實雙探針測定是穩(wěn)健的，甚 至在靶數(shù)量顯著變化時也可工作。在PCR產(chǎn)物的分析中，通過模板數(shù)量和聚合酶反應(yīng)產(chǎn)率來 測定靶濃度。無需對測定條件進行嚴格控制而測定樣品基因型的能力是高度所需的。
[0094]為了檢查突變檢測敏感性，使用雙納米探針方法分析總濃度為IOOnm的一系列雜 合樣品。圖6示出作為MUT/WT比率的函數(shù)的Tm值。當比率小于20%時，TmWT的值與TmWT_WT相 同。另一方面，TmMUT的值大大高于TmMUT_WT，只要比率大于2%即可。因此，對于高度異質(zhì)的 樣品，TmWT的值可用作TmMUT_WT并且可用于根據(jù)圖5確定Tm眶_訂的對應(yīng)值。突變序列的存 在導(dǎo)致T mMUT的值高于TmMUT_WT的值。 實施例2:采用雙納米探針方法進行基因分型
[0095]用于分析人p53基因的密碼子280基因型的實驗工作流程在圖7中示出。從具有已 知基因型的兩個細胞系，即MCF-7 (野生型）和MDA-MB-231 (純合突變)提取gDNA樣品。通過 (以1:1比率）混合提取自MCF-7和MASMB-231細胞系的gDNA樣品來獲得雜合樣品。將這些 gDNA樣品用作模板，通過PCR產(chǎn)生319bp的DNA片段。用于PCR的反向引物是磷酸標記的。凝膠 電泳顯示所需片段的特異性擴增(圖8)。
[0096]在PCR之后，通過對擴增子的磷酸標記的鏈進行λ-核酸外切酶消化來獲得ssDNA靶 (Higuchi ,RG和Ochman,H(1989)Nucleic Acids Res ,17,5865-5865)。接著，將ssDNA產(chǎn)物的 兩個等分試樣分別與WT和MUT探針混合，并且測量TmwWPTmMUT。未進行PCR后清理。圖9示出 細胞系樣品的基因分型的散點圖。所有基因型均得以正確明確的測定。
[0097] 注意到測定在引物、聚合酶和λ-核酸外切酶的存在下良好地工作，這表明納米探 針與這些物質(zhì)之間的弱相互作用。納米探針在DNA序列識別中的高特異性排除了引物附著 的可能性。由于MOR的非離子和親水性質(zhì)，納米探針還顯示出對蛋白質(zhì)的低親和力。這些特 征使得納米探針在分析復(fù)雜樣品方面具有穩(wěn)健性，從而極大地簡化了測定工作流程。 實施例3:高度異質(zhì)樣本的分析的敏感性
[0098] 先前的研究表明，納米探針的獨特特征允許對低水平突變體的敏感檢測(Zu，Y等 人，（2011)Small，7,306-310)。在本文中，在高度異質(zhì)樣本的分析中使用雙納米探針測定。 [0099] 通過以不同比率混合提取自MDB-MB-231和MCF-7細胞系的gDNA來制備一系列異質(zhì) 樣品。圖10示出作為gDNA比率的函數(shù)的T mwWPTmMUT的值。類似于通過使用合成DNA樣品獲 得的結(jié)果（圖6)，TmWT的值可用于確定TmMUT的下限（即，TmMUT_WT，針對100%的WT靶獲得的 值）。如果TmMUT的測量值比下限高U 2°C)，則檢測到體細胞突變。基于此標準，針對p53突 變檢測的雙納米探針測定的敏感性為~5 %。該測定的敏感性高于Sanger測序(敏感性~ 20% )，并且與一些PCR富集技術(shù)相當（Higuchi ,RG和Ochman,H(1989)Nucleic Acids Res, 17,5865-5865)。作為端點檢測方法，該測定與基于PCR的靶富集策略相容。當結(jié)合等位基因 特異性PCR或鉗制PCR使用雙納米探針測定時，將預(yù)期到較高的敏感性。 實施例4:華法林敏感性試驗試劑盒的開發(fā)
[0100]在此研究中，采用3對WT和MUT納米探針來測量與華法林敏感性相關(guān)聯(lián)的3個SNP (SEQ ID No. 7-12)。納米探針可穩(wěn)定分散在5mM磷酸鹽緩沖溶液(pH~7.5)中。然而，在與 50mM NaCl-起溫育1分鐘后發(fā)生清楚的色變。
[0101] 首先，測試納米探針在識別合成DNA靶方面的特征（SEQ ID No. 13-18和圖11)。在 2 5nm完全匹配的靶、單堿基錯配的靶或它們的1:1混合物(表示雜合靶）的存在下，納米探 針變得穩(wěn)定并且在室溫下未觀察到色變，甚至在與50mM NaCl-起溫育1天后也是如此。隨 著溫度升高，基于比色信號獲得納米探針-靶雜交體的!^值。Tm通常隨著靶數(shù)量的增加而增 加。在任意給定靶濃度下，單堿基錯配導(dǎo)致TJl乎一致的降低。
[0102] 每對納米探針的（TmWT_TmMUT)散點圖在圖12中示出。在較大的合成靶濃度范圍 (5nM至500nM)內(nèi)，與3類靶序列對應(yīng)的3個數(shù)據(jù)點組在它們的特定線性區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，并且彼 此明顯區(qū)分。
[0103] 通過執(zhí)行簡單的工作流程在對來自健康志愿者的臉頰拭子的人gDNA的分析過程 中檢查新的基因分型平臺（圖13)。當用商業(yè)試劑盒從樣品中提取gDNA后，進行aPCR以產(chǎn)生 ssDNA 靶。
[0104] 該測定包括3次aPCR反應(yīng)來擴增包含SNP的序列片段。對引物進行設(shè)計并優(yōu)化，使 得擴增可在相同的熱循環(huán)條件下進行(SEQ ID No. 19-24和圖14和16)。在aPCR之后，將每一 反應(yīng)產(chǎn)物的兩個等分試樣分別與特定的WT和MUT探針混合。接著，基于尖銳的解鏈轉(zhuǎn)變測量 靶/納米探針雜交體的1^值（圖15和17)。通過對對應(yīng)標準圖中所獲得的1"數(shù)據(jù)進行繪圖，可 指定樣品的基因型（圖12)。該方案不包括任何純化和洗滌步驟，并且可在2小時內(nèi)完成。
[0105] 對上文進行匯總并且將本發(fā)明與其他