基因分型平臺(tái)進(jìn)行比較，注意到基于納米探 針的技術(shù)表現(xiàn)出一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。首先，簡(jiǎn)單的溶液相測(cè)定導(dǎo)致高度可再現(xiàn)的結(jié)果。均勻分 散的納米探針與DNA靶在溶液中快速雜交。不涉及后PCR清理和雜交后洗滌步驟，從而大大 簡(jiǎn)化了檢測(cè)并且避免了對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行嚴(yán)格控制的需求。其次，由于極其尖銳的解鏈轉(zhuǎn)變 和明顯的色變，納米探針在識(shí)別DNA序列方面具有高度特異性，從而確保了測(cè)定的特異性和 準(zhǔn)確性。再次，等離子體納米探針允許低成本比色檢測(cè)，而非需要復(fù)雜光學(xué)元件和算法的基 于熒光團(tuán)的檢測(cè)。由于所需的唯一儀器為標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀，因此平臺(tái)可容易地與PCR-起部署 在任何實(shí)驗(yàn)室中，而無(wú)需另外的資本設(shè)備投資。此外，溶液相測(cè)定可容易地與微流體系統(tǒng)整 合以使測(cè)定小型化和自動(dòng)化并且實(shí)現(xiàn)護(hù)理點(diǎn)檢驗(yàn)。
[0106] 本文中已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了寬泛的和一般性的描述。落入概括性公開(kāi)內(nèi)容中的每一 較窄的種類(lèi)和亞類(lèi)也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括由附帶條件或負(fù)面限制從所述類(lèi)屬中排 除任何主題后的對(duì)本發(fā)明的概括性描述，無(wú)論被排除的材料是否在本文中被明確敘述。其 他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。此外，當(dāng)本發(fā)明的特征和方面根據(jù)馬庫(kù)什群組進(jìn) 行描述時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也因此根據(jù)該馬庫(kù)什群組的任何單個(gè)成員或 成員亞組進(jìn)行描述。
[0107] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于了解，本發(fā)明充分適于執(zhí)行目標(biāo)并且獲得所提到的以及其 中固有的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。另外，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本發(fā)明精神和 范圍的前提下可對(duì)本文公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)行各種替換和修改。本文描述的組合物、方法、工序、 處理、分子和特定化合物為當(dāng)前優(yōu)選實(shí)施方案的代表，其為示例性的并且不旨在限制本發(fā) 明的范圍。本發(fā)明的精神內(nèi)涵蓋的本領(lǐng)域技術(shù)人員想到的其中的改變和其他用途由權(quán)利要 求的范圍限定。本說(shuō)明書(shū)中對(duì)先前出版文獻(xiàn)的列示或討論不應(yīng)必然被認(rèn)為承認(rèn)所述文獻(xiàn)是 現(xiàn)有技術(shù)水平的一部分或普遍的一般知識(shí)。
[0108] 可將本文示例性描述的發(fā)明適宜地在不存在本文未具體公開(kāi)的任何一個(gè)或多個(gè) 要素、任何一個(gè)或多個(gè)限制的情況下實(shí)施。因此，例如，術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"、"含有"等應(yīng)廣 義地閱讀并且沒(méi)有限定。詞語(yǔ)"包含"或變型，例如"包括"或"含有"將相應(yīng)地被理解為暗示 包含所述整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)組。因此，本文已采用的術(shù)語(yǔ)和措辭 是用作描述性而非限制性的術(shù)語(yǔ)，并且在這類(lèi)術(shù)語(yǔ)和措辭的使用中并不意圖排除所示的和 所描述的特征或其部分的任何等同物，而是應(yīng)認(rèn)識(shí)到在受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的本發(fā)明的范圍 之內(nèi)可以作出各種修改形式。因此，應(yīng)當(dāng)理解，盡管已經(jīng)通過(guò)示例性實(shí)施方案和任選特征具 體公開(kāi)了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到本文公開(kāi)的其中體現(xiàn)的本發(fā)明的修改和變型， 并且認(rèn)為此類(lèi)修改和變型在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0109] 本文中所引用的所有文獻(xiàn)和專(zhuān)利文件的內(nèi)容均整體以引用的方式并入本文。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)樣品中的靶核酸分子中的突變的方法，其包括以下步驟： (i) 使包含第一納米粒子和第一寡核苷酸類(lèi)似物的第一綴合物與包含靶核酸序列的等 分試樣在允許所述第一綴合物和所述靶核酸分子彼此雜交的條件下接觸，以形成第一綴合 物:革E核酸分子復(fù)合物， 其中所述第一寡核苷酸類(lèi)似物為與所述第一納米粒子共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡 聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸類(lèi)似物包含與所述靶核酸的野生型序列互 補(bǔ)的喊基序列； (ii) 使包含第二納米粒子和第二寡核苷酸類(lèi)似物的第二綴合物與包含所述靶核酸序 列的另一等分試樣在允許所述第二綴合物和所述靶核酸分子彼此雜交的條件下接觸，以形 成第二綴合物:靶核酸分子復(fù)合物， 其中所述第二寡核苷酸類(lèi)似物為與所述第二納米粒子共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡 聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第二寡核苷酸類(lèi)似物包含堿基序列，所述堿基序列與所述 靶核酸的突變序列互補(bǔ)并且與所述第一寡核苷酸類(lèi)似物的所述堿基序列相差至少一個(gè)核 堿基，并且其中所述第一寡核苷酸類(lèi)似物和所述第二寡核苷酸類(lèi)似物具有至少85%的序列 同一 1性;和 (iii) 測(cè)定步驟(i)和(ii)的所述復(fù)合物的解鏈溫度Tm并通過(guò)比較所述復(fù)合物的Tm來(lái)檢 測(cè)所述靶核酸分子是否包含所述突變。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括在步驟（i)之前通過(guò)PCR擴(kuò)增所述靶核酸分子 的步驟。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述樣品為異質(zhì)樣品。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶核酸分子包含SEQ ID No.3、4、 13、14、15、16、17或18所示的核苷酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO: 1 所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID N0:2所示的堿基序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQ ID N0:7 所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID N0:8所示的堿基序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQ ID N0:9 所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID N0:10所示的堿基序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO: 11 所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID N0:12所示的堿基序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述磷酰二胺嗎啉代寡聚物或其衍生 物的單體單元由式(I)表示 . \ ! ......... V" ^sJf，·"·》…wwww 0x/ 7 (I) t- 其中 Pi為與另一嘌呤或嘧啶堿基形成沃森-克里克堿基對(duì)的嘌呤或嘧啶堿基;并且 X為順2、NHR或NR2，其中R為Cl -C6烷基。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中與所述Pi的嘌呤或嘧啶堿基形成沃森-克里克堿基 對(duì)的所述另一嘌呤或嘧啶堿基為核堿基。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中X為NR2并且R為甲基。12. 根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嘌呤或嘧啶堿基為選自腺嘌呤 (A)、胞嘧啶(C)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的核堿基。13. 根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嘌呤或嘧啶堿基為選自5-甲基 胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶核苷（Ψ)、二氫尿嘧啶核苷(D)、肌苷（I)和7-甲基鳥(niǎo)苷(m7G)、黃嘌 呤和次黃嘌呤的核堿基。14. 一種試劑盒，其包含第一綴合物和第二綴合物或由第一綴合物和第二綴合物組成， 所述第一綴合物包含第一納米粒子和第一寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述第一寡核苷酸類(lèi) 似物為與所述第一納米粒子共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，并且 所述第二綴合物包含第二納米粒子和第二寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述第二寡核苷酸類(lèi) 似物為與所述第二納米粒子共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)或其衍生物， 其中所述第一寡核苷酸類(lèi)似物與所述第二寡核苷酸類(lèi)似物相差至少一個(gè)核堿基，并且 其中所述第一寡核苷酸類(lèi)似物與所述第二寡核苷酸類(lèi)似物具有至少85%的序列同一性。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中所述第一和/或所述第二納米粒子為金屬納米 粒子。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述金屬為貴金屬。17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述貴金屬選自金、銀、鉑、鈀、釕、鋨、銥及其 混合物。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述貴金屬為金。19. 根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述納米粒子的直徑在約lnm至 約1 OOnm的范圍內(nèi)。20. 根據(jù)權(quán)利要求14至19中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述磷酰二胺嗎啉代寡聚物或 其衍生物的單體單元由式(I)表示 Τ) ! QssksP--Κ ?， 其中 Ρι為與另一嘌呤或嘧啶堿基形成沃森-克里克堿基對(duì)的嘌呤或嘧啶堿基;并且 X為順2、NHR或NR2，其中R為Cl -C6烷基。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中與所述Pi的嘌呤或嘧啶堿基形成沃森-克里克 堿基對(duì)的所述另一嘌呤或嘧啶堿基為核堿基。22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的試劑盒，其中X為NR2并且R為甲基。23. 根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述嘌呤或嘧啶堿基為選自腺 嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的核堿基。24. 根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述嘌呤或嘧啶堿基為選自5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶核苷（Ψ)、二氫尿嘧啶核苷(D)、肌苷（I)和7-甲基鳥(niǎo)苷(m7G)、 黃嘌呤和次黃嘌呤的核堿基。25. 根據(jù)權(quán)利要求14至24中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸類(lèi)似物和第 二寡核苷酸類(lèi)似物包含約15至約35個(gè)單體單元。26. 根據(jù)權(quán)利要求14至25中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸類(lèi)似物包含 SEQ ID NO: 1所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO:2所示的堿基序列。27. 根據(jù)權(quán)利要求14至25中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸包含SEQ ID N0:7所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID N0:8所示的堿基序列。28. 根據(jù)權(quán)利要求14至25中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸包含SEQ ID N0:9所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID N0:10所示的堿基序列。29. 根據(jù)權(quán)利要求14至25中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸包含SEQ ID N0:11所示的堿基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQ ID N0:12所示的堿基序列。30. 根據(jù)權(quán)利要求14至29中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述至少一種寡核苷酸類(lèi)似物 經(jīng)由官能團(tuán)與所述納米粒子共價(jià)偶聯(lián)。31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述官能團(tuán)包含硫醇基團(tuán)。32. 根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的試劑盒，其中所述官能團(tuán)為連接分子的一部分。33. 根據(jù)權(quán)利要求14至32中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含PCR引物。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述PCR引物包含SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6 所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列組成。35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述PCR引物選自由SEQ ID NO: 19和SEQ ID N0:20;SEQIDN0:21和SEQIDN0:22;以及SEQIDN0:23和SEQIDN0:24組成的引物對(duì)。36. 根據(jù)權(quán)利要求14至35中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一綴合物和所述第二綴 合物儲(chǔ)存在各自的容器中。37. 根據(jù)權(quán)利要求14至35中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一綴合物和所述第二綴 合物一起儲(chǔ)存在一個(gè)容器中。38. 根據(jù)權(quán)利要求14至37中任一項(xiàng)所述的試劑盒用于檢測(cè)靶核酸分子中的突變或用于 將基因型指定給靶核酸的用途。
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)涉及檢測(cè)靶核酸分子中的突變的方法。相差至少一個(gè)堿基的兩個(gè)磷酰二胺嗎啉代寡聚物探針各自與納米粒子共價(jià)偶聯(lián)并且與靶序列雜交。對(duì)所述兩個(gè)探針中的每一者與所述靶核酸之間的復(fù)合物的解鏈溫度進(jìn)行測(cè)量并比較以確定樣品是否包含具有所述突變的核酸。另外，本發(fā)明涉及包含如本文所述的第一綴合物和第二綴合物的試劑盒以及此類(lèi)試劑盒用于檢測(cè)靶核酸分子中的突變或用于將基因型指定給靶核酸分子的用途。
【IPC分類(lèi)】B82Y15/00, C12Q1/68, C07H21/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105473736
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480029699
【發(fā)明人】祖延兵, 應(yīng)儀如
【申請(qǐng)人】新加坡科技研究局
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2014年4月4日
【公告號(hào)】EP2984183A1, US20160046993, WO2014168582A1