一種巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子三環(huán)小分子抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)三環(huán)小分子抑 制劑，尤其涉及一種對MIF的互變異構(gòu)酶活性以及MIF接到的炎癥、細(xì)胞增殖具有強(qiáng)烈抑制 作用的小分子化合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)是一種含有115個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量為 12.5kDa，是由α鏈和β鏈組成的三維結(jié)構(gòu)。MIF的蛋白晶體結(jié)構(gòu)是一個(gè)同源三聚體，每個(gè)單體 有兩個(gè)平行的α螺旋和6個(gè)β鏈組成。
[0003] MIF的重要來源之一是腦垂體，占垂體蛋白總量的0.05 %。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞也 是MIF的重要來源之一。此外，淋巴細(xì)胞也表達(dá)MIFJIF可與細(xì)胞膜表面蛋白⑶74的細(xì)胞外 基團(tuán)結(jié)合而發(fā)揮作用。MIF與CD74的細(xì)胞外基團(tuán)，即73-232位的氨基酸殘基高親和結(jié)合，激 活ERK1/2和AKT蛋白激酶，從而引起各種細(xì)胞的增殖和炎性因子的釋放，產(chǎn)生各種生理和病 理反應(yīng)。MIF是一種獨(dú)特的蛋白質(zhì)，它參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管生成等。MIF 與多種疾病相關(guān)，包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化癥、腎小球腎炎、Crohn病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、中風(fēng)、脊 髓損傷。
[0004] MIF具有互變異構(gòu)酶活性，可以催化D-多巴色素、苯丙酮酸的互變異構(gòu)化。MIF還能 催化硫醇蛋白的氧化還原反應(yīng)。由于涉及多種炎癥、免疫、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā) 展，MIF已成為上述疾病的重要靶點(diǎn)。
[0005] 目前針對MIF的治療策略主要是靶向其互變異構(gòu)酶活性中心發(fā)展小分子抑制劑。 但目前發(fā)現(xiàn)的MIF小分子抑制劑普遍活性較低，至今還沒有針對MIF的小分子抑制劑成功上 市。因此，開發(fā)高活性的MIF小分子抑制劑對于治療包括動(dòng)脈粥樣硬化癥、腎小球腎炎、 Crohn病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)、神經(jīng)退 行性疾病、糖尿病、中風(fēng)、脊髓損傷在內(nèi)的多種疾病具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，本發(fā)明旨提供一種巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)三環(huán) 小分子抑制劑，以期抑制MIF介導(dǎo)的炎癥、免疫和細(xì)胞增殖功能。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)三環(huán)小分子抑制劑 的分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0009] 其中，R1、!?2、!?3和R4獨(dú)立選自于包含如下基團(tuán)的組合：氫、鹵素、C1-C3烷基、雜烷 基、芳香基、雜芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)和鹵代烷基;R 5、R6和R8獨(dú)立選自于包含如下基團(tuán)的組 合:硫基、氧基、氮基、雜烷基、芳香基、雜芳烷基;R 7獨(dú)立選自于包含如下基團(tuán)的組合:羥基、 鹵素、雜烷基、芳香基、芳氧基、雜芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)和鹵代烷基等。
[0010] 進(jìn)一步的，所述的MIF三環(huán)小分子抑制劑的衍生物之一為FGH-1001，其分子結(jié)構(gòu)式 如下：
[0012] 本發(fā)明基于MIF的晶體結(jié)構(gòu)對包含超對100萬個(gè)化合物的Chembridge和Specs兩個(gè) 化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選，獲得對MIF的互變異構(gòu)酶活性具有高強(qiáng)度選擇性抑制作用的 小分子化合物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽和前體藥，在體外試驗(yàn)中能抑制MIF介導(dǎo)的ERK1/2 的活化，抑制單核細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制炎癥反應(yīng)。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0014] 本發(fā)明的MIF三環(huán)小分子抑制劑抑制用于治療包括動(dòng)脈粥樣硬化癥、腎小球腎炎、 Crohn病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)、神經(jīng)退 行性疾病、糖尿病、中風(fēng)、脊髓損傷在內(nèi)的多種疾病。
【附圖說明】
[0015] 此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本發(fā) 明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0016] 圖1是本發(fā)明的FGH-1001對MIF的互變異構(gòu)酶活性的抑制作用示意圖。
[0017]圖2是本發(fā)明的FGH-1001對MIF-CD74結(jié)合的抑制作用示意圖。
[0018]圖3是本發(fā)明的FGH-1001對BV2細(xì)胞AKT磷酸化的抑制作用示意圖。
[0019]圖4是本發(fā)明的FGH-1001對BV2細(xì)胞增殖的抑制作用示意圖。
[0020]圖5是本發(fā)明的FGH-1001對U251細(xì)胞增殖的抑制作用示意圖。
[00211圖6是本發(fā)明的FGH-1001對胰腺癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用示意圖 [0022]圖7是本發(fā)明的FGH-1001對胰腺癌細(xì)胞生長的抑制作用示意圖。
[0023]圖8是本發(fā)明的FGH-1001對胰腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成的抑制作用示意圖。
[0024]圖9是本發(fā)明的FGH-1001對LPS誘導(dǎo)的炎癥的抑制作用示意圖。
[0025]圖10是本發(fā)明的FGH-1001對缺血性中風(fēng)后腦組織損傷的抑制作用示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本實(shí)施例基于MIF的晶體結(jié)構(gòu)，對包含超對100萬個(gè)化合物的Chembridge和Specs 兩個(gè)化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選。經(jīng)過RE0S規(guī)則過濾和基于分子指紋的聚類分析后，對170 個(gè)化合物進(jìn)行D-多巴色素互變異構(gòu)酶活性試驗(yàn)，獲得了一系列的具有微摩爾級活性的MIF 互變異構(gòu)酶抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0028] 其中，R\R2、R3和R4獨(dú)立選自于包含如下基團(tuán)的組合:氫、鹵素、C1-C3烷基、雜烷 基、芳香基、雜芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)和鹵代烷基;R5、R6和R8獨(dú)立選自于包含如下基團(tuán)的組 合:硫基、氧基、氮基、雜烷基、芳香基、雜芳烷基;R 7獨(dú)立選自于包含如下基團(tuán)的組合:羥基、 鹵素、雜烷基、芳香基、芳氧基、雜芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)和鹵代烷基等。
[0029] 優(yōu)選的，所述的MIF三環(huán)小分子抑制劑的衍生物之一為FGH-1001，其分子式如下：
[0031 ] 如圖1所示，所述的MIF三環(huán)小分子抑制劑FGH-1001抑制MIF的互變異構(gòu)酶活性。如 圖所示，將不同濃度的FGH-1001與10nM MIF和ΙμΜ D多巴色素進(jìn)行反應(yīng)，用多巴色素異構(gòu)酶 ELISA檢測試劑盒測定MIF的相對活性，求出品pIC50值。結(jié)果為三次實(shí)驗(yàn)所得的平均數(shù)土標(biāo) 準(zhǔn)差。結(jié)果:FGH-1001濃度依賴性地抑制MIF的互變異構(gòu)酶活性。pIC50為6.0±0.15。
[0032] 如圖2所示，所述的MIF三環(huán)小分子抑制劑FGH-1001對BV2細(xì)胞AKT活性的抑制作 用，如圖所示，將不同濃度的FGH-1001與10nM MIF和10nM CD74進(jìn)行反應(yīng)，用分光光度計(jì)檢 測MIF-⑶74的結(jié)合百分比，求出品pIC50值。結(jié)果為三次實(shí)驗(yàn)所得的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果： FGH-1001濃度依賴性地抑制MIF-CD74的結(jié)合，pIC50為6.6 ±0.25。
[0033]如圖3所示，所述的MIF三環(huán)小分子抑制劑FGH-1001對單核細(xì)胞增殖的抑制作用， 如圖所示，將不同濃度的FGH-1001與BV2細(xì)胞(5xl06)孵育12小時(shí)后裂解細(xì)胞，用SDS-PAGE 和Western blot檢測方法檢測AKT的磷酸化水平以及總的AKT的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:FGH- 1001濃度依賴性地抑制BV2細(xì)胞AKT的磷酸化。
[0034] 如圖4所示，將不同濃度的FGH-1001與BV2細(xì)胞(5xl06)孵育24小時(shí)后用MTT檢測法 測定細(xì)胞的增殖程度。結(jié)果:FGH-1001濃度依賴性地抑制BV2細(xì)胞增殖，三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析， pIC50 = 6.3±0.35。
[0035] 如圖5所示，將不同濃度的FGH-1001與U251細(xì)胞（5xl06)孵育24小時(shí)后用MTT檢測 法測定細(xì)胞的增殖程