對的替換、增 添、缺失引起的改變。所述基因改造包括但不限于目標基因的敲入、目標基因的敲除等。目 標基因的敲入、目標基因的敲除可以采用基因打靶、同源重組等技術(shù)來完成。
[0019]優(yōu)選地，本發(fā)明另一實施例中，如SEQ ID勵.2所示的奸〇基因被敲除并替換為卩1^ 位點序列。所述FRT位點序列如SEQ ID N0.3所示，具體為：
[0020] Tgggaattagccatggtccatatgaatatcctccttagttcctattccgaagttcctattctctagaagtataggaa cttcgaagctgctccagcctaca。
[0021]上述FRT位點序列的引入，并不影響雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株的 性能。
[0022]本發(fā)明的第二方面，提供了前述雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株的構(gòu)建 方法，包括步驟:將雞白痢沙門菌中的spiC基因和rfc基因都敲除。
[0023]可以采用現(xiàn)有的基因編輯方法敲除所述spiC基因和rfc基因。優(yōu)選地，可采用同源 重組的方法敲除spiC基因和rfc基因。在優(yōu)選的實施例中，采用Red同源重組的方法敲除 spiC基因和rfc基因。還可采用其他方法實現(xiàn)基因敲除，并不限于實施例所列舉的方式。 [0024] 基于spiC基因的敲除，spiC基因的完整序列從染色體DNA中去除；基于rfc基因的 敲除，rfc基因的完整序列從染色體DNA中被去除。
[0025]在一實施例中，先構(gòu)建spiC基因敲除的雞白痢沙門菌突變株，并在此基礎(chǔ)上敲除 rfc基因。
[0026]本發(fā)明的第三方面，提供了前述雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株在制備 雞白痢沙門菌活疫苗中的用途。
[0027] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種雞白痢沙門菌活疫苗，含有前述雞白痢沙門菌 spiC-rfc雙基因敲除減毒株。
[0028] 進一步的，所述雞白痢沙門菌活疫苗中還含有佐劑。
[0029]本發(fā)明的第五方面，提供了 spiC基因和rfc基因共同作為靶基因在篩選雞白痢沙 門菌感染治療藥物中的用途。
[0030] 本發(fā)明所述雞白痢沙門菌感染治療藥物為以spiC基因和rfc基因為治療靶基因， 使spiC基因和rfc基因敲除、不表達的藥物或者以spiC基因和rfc基因表達的蛋白為拮抗對 象的藥物；或者以spiC基因、rfc基因和其他基因共同作為靶基因加以沉默的藥物。以spiC 基因和rfc基因為靶點，篩選使這兩個基因不表達的藥物，用于使雞白痢沙門菌毒性減弱， 以治療雞白痢沙門菌感染。例如，該雞白痢沙門菌感染治療藥物可以通過RNA干擾或者基因 重組的方法使spiC基因和rfc基因敲除或不表達；或者通過制備spiC蛋白和rfc蛋白詰抗 劑，使spiC基因和rfc基因表達的蛋白不發(fā)揮作用。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0032]本發(fā)明旨研制了一種spiC-rfc雙基因敲除的雞白痢沙門菌減毒株，本發(fā)明通過動 物試驗發(fā)現(xiàn)，所述突變株毒力顯著降低，在宿主體內(nèi)定殖時間明顯縮短，接種后雞只無不良 反應(yīng)，對強毒力雞白痢沙門菌提供良好的保護作用，可有效清除強毒力菌株感染。
[0033]進一步的，采用所述減毒株做制備的雞白痢沙門菌活疫苗，其毒力相對于野生型 雞白痢沙門菌顯著降低，表現(xiàn)在其對1日齡海蘭白雛雞的致死劑量明顯提高。接種本發(fā)明雞 白痢沙門菌減毒活疫苗后，宿主不產(chǎn)生針對〇-抗原的抗體，通過雞白痢雞傷寒多價檢測抗 原，可有效的應(yīng)用玻板凝集試驗對免疫接種雞和自然感染雞予以區(qū)分。所述疫苗具有良好 的免疫原性，對雛雞可提供堅實的免疫保護效果，并且可以通過玻板凝集試驗快速地區(qū)分 疫苗接種雞與自然感染雞。亦即，所述疫苗具有區(qū)分免疫接種雞和自然感染雞的功能，通過 玻板凝集試驗即可加以區(qū)別，疫苗應(yīng)用不影響雞白痢陽性雞檢疫淘汰制度的實施。
【附圖說明】
[0034] 圖1:雞白痢沙門菌rfC基因打祀片段的PCR擴增。M:DL2000DNA Marker; 1:P1/P2擴 增產(chǎn)物。
[0035] 圖2:減毒株S06004 Δ SpiC Δ rfc的PCR鑒定。M: λ-EcoTHDNA Marker; 1: S06004; 2: S06004A spiCArfc: :Cm〇
[0036] 圖3:敲除株的吖啶橙凝集試驗。1:S06004;2:S06004 Δ SpiC Δ rfc。
[0037] 圖4:敲除株LPS結(jié)構(gòu)的SDS-PAGE銀染分析。1: S06004; 2: S06004 Δ SpiC Δ rfc。
[0038] 圖5:雞白痢沙門菌減毒株在雛雞肝臟、脾臟內(nèi)的定殖。A:肝臟;B:脾臟。代表 減毒株。
[0039] 圖6:免疫后雛雞體重變化。" △"代表減毒株。
[0040] 圖7:免疫雛雞清除強毒力沙門菌感染的效率。代表減毒株。
[0041 ]圖8 :敲除株具有區(qū)分疫苗接種動物和自然感染動物的DIVA性能。1: S06004; 2 : S06004 Δ spiC Δ rfc。"d.p. i"表示免疫后天數(shù)。
【具體實施方式】
[0042]在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法， 通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0043]當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0044]除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY?John ffiley&Sons?New York?1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY .Academic Pressman Diego ； Wolf fe ? CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，V〇1.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0045] 實施例1雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株S06004 AspiC Arfc的構(gòu)建
[0046] 1.材料和方法
[0047] 1.1菌株與質(zhì)粒
[0048]雞白痢沙門菌S06004A spiC突變株由本發(fā)明人實驗室利用重組自殺質(zhì)粒方法無 痕敲除spiC基因構(gòu)建獲得并保存(所述雞白痢沙門菌S06004 AspiC突變株為現(xiàn)有技術(shù)，其 具體的構(gòu)建方法詳見"雞白痢沙門菌S06004 △ spiC突變株的構(gòu)建與鑒定，中國獸醫(yī)科學， 2014年 04 期"）。
[0049]雞白痢沙門菌S06004(NalR)、E.coli DH5a、E.coli Spy372(Apir)以及質(zhì)粒pKD46 (AmpR)、pKD