mir-1299及其成熟miRNA的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及mir-1299及其成熟miRNA的新用途，更具 體的涉及mir-1299及其成熟miRNA的新用途在診治骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子，通過特異性結(jié)合靶基因來調(diào)控基因的表達(dá)。其 調(diào)控的主要方式有兩種：一種是與靶基因 mRNA的3'UTR不完全互補配對，阻斷靶基因的翻 譯，從而調(diào)芐基因表達(dá)；另一種是與siRNA類似，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補配對時，Ago2蛋白 通過切割mRNA直接導(dǎo)致其降解，實現(xiàn)基因沉默?？傊?，當(dāng)前認(rèn)為miRNA以何種方式與目的基 因作用和miRNA與目的基因的配對程度有關(guān)。miRNA與目的基因配對不完全時，miRNA就以抑 制目的基因的表達(dá)發(fā)揮作用;miRNA與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因 在互補區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。另外，miRNAs有時候也導(dǎo)致組氨酸修飾和啟動子區(qū)的DNA甲 基化，從而影響靶基因的表達(dá)。研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防 御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，具有重要的基因表達(dá)調(diào)控作用。
[0003] 骨肉瘤(osteosarcoma，0SA)是常見的惡性骨腫瘤，由惡性增殖的肉瘤細(xì)胞直接產(chǎn) 生腫瘤性骨樣組織或不成熟骨，其組織學(xué)特點是增生的梭形腫瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生骨樣基質(zhì)或 不成熟骨，幾乎所有骨肉瘤轉(zhuǎn)移均經(jīng)血液轉(zhuǎn)移至肺，少數(shù)轉(zhuǎn)移至腦、腎等內(nèi)臟器官及經(jīng)淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移。骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后?；蛩降闹委熞呀?jīng)成為 廣大學(xué)者的研究熱點，但是目前仍缺少骨肉瘤診斷和治療的有效靶標(biāo)，進一步尋找分子生 物標(biāo)記，將具有重要的理論和臨床應(yīng)用價值。同時如能獲得骨肉瘤血清診斷標(biāo)志物，將對骨 肉瘤的診斷和治療帶來深遠(yuǎn)的影響。
[0004] 本發(fā)明基于高通量測序方法，對5例轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者及5名健康對照人群進行測 序，獲得其miRNA和mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)，進而進行生物信息學(xué)分析，選取后備miRNA和mRNA進行 分子生物學(xué)驗證及靶標(biāo)驗證，結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的miR-1299及其靶基因與骨肉瘤密切 相關(guān)，可用于骨肉瘤的臨床診斷及預(yù)防檢測，具有很好的實際應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供mir-1299及其成熟miRNA在制備診斷和/或防治骨肉瘤試 劑中的應(yīng)用。miR-1299的序列見序列表SEQ ID NO l，mir-1299序列見序列表SEQ ID N0 2。
[0006] 進一步，骨肉瘤為轉(zhuǎn)移性骨肉瘤。優(yōu)選的，診斷和/或防治骨肉瘤試劑為診斷和/或 防治骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的試劑。
[0007] 進一步，診斷骨肉瘤試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或 基于探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測方法 檢測骨肉瘤樣本中mir-1299及其成熟miRNA調(diào)控的革E1基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用northern 雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞 術(shù)檢測骨肉瘤樣本中mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄;采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測 骨肉瘤樣本中mir-1299及其成熟miRNA調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。優(yōu)選所述mir-1299及其 成熟miRNA調(diào)控的靶基因為C5AR1和/或ITPRIP。
[0008]優(yōu)選的，基于定量PCR方法包括特異性擴增mir-1299及其成熟miRNA的引物，進一 步優(yōu)選，特異性擴增miR-1299的引物序列為SEQ ID N0 3;基于探針雜交方法包括與mir-1299 及其成熟 miRNA 的核酸序列雜交的探針; 免疫檢測方法包括與 mir-1299 及其成熟 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)蛋白特異性結(jié)合的抗體，進一步優(yōu)選與C5AR1和/或ITPRIP蛋白特異性結(jié)合的 抗體。
[0009] 進一步，防治骨肉瘤試劑包括上調(diào)mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-1299 及其成熟 miRNA 的活性的試劑。
[0010] 優(yōu)選的，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術(shù)和/或基因特異性miR Mimics技 術(shù)上調(diào)mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-1299及其成熟miRNA的活性。優(yōu)選人 工合成miR-1299的短發(fā)夾RNA或通過調(diào)控啟動子上調(diào)mir-1299及其成熟miRNA。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供mir-1299及其成熟miRNA的靶基因在制備診斷和/或防治 骨肉瘤制劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，靶基因為C5AR1或ITPRIP。更優(yōu)選的，靶基因為ITPRIP。
[0012] 進一步的，骨肉瘤為轉(zhuǎn)移性骨肉瘤。
[0013] 進一步，診斷骨肉瘤制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、免疫方法檢測骨肉 瘤患者外周血中C5AR1和/或ITPRIP3基因的表達(dá)。優(yōu)選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含 有特異性擴增C5AR1和/或ITPRIP基因的引物;所述的基因芯片中包括與C5AR1和/或ITPRIP 基因的核酸序列雜交的探針。更優(yōu)選的，熒光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測C5AR1和/或 ITPRIP基因的上游引物和下游引物，擴增C5AR1的上游引物序列為SEQ ID N0 4,下游引物 序列為SEQ ID N0 5;擴增ITPRIP基因的上游引物序列為SEQ ID N0 6,下游引物序列為SEQ ID NO 7〇
[0014] 進一步，骨肉瘤的診斷制劑采用免疫方法檢測骨肉瘤外周血中C5AR1和/或ITPRIP 基因的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選的，免疫方法為ELISA檢測和/或膠體金檢測。進一步，檢測C5AR1和/ 或ITPRIP蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。試劑盒中的抗體可采用市售的C5AR1和/ 或ITPRIP單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，試劑盒包括:包被C5AR1和/或ITPRIP抗體的固 相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。
[0015] 進一步，檢測C5AR1和/或ITPRIP蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，抗體可采用 市售的C5AR1和/或ITPRIP單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，膠體金檢測試劑盒采用膠體 金免疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。進一步，膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)（T) 噴點有抗C5AR1和/或ITPRIP抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供上述骨肉瘤診斷制劑在制備骨肉瘤診斷工具中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的目的在于提供一種防治骨肉瘤的制劑，制劑中含有抑制C5AR1和/或 ITPRIP基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。進一步的，C5AR1和/或ITPRIP基因、基因的表達(dá) 產(chǎn)物在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組中高表達(dá)。
[0018] 本領(lǐng)域人員熟知抑制基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N 和/或幾種:激活該基因的抑制基因、加入抑制該基因的蛋白、加入抑制該基因的化學(xué)品（如 siRNA等）、加入促進蛋白降解或阻斷蛋白成熟的分子、去除激活該基因的蛋白等。
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種防治骨肉瘤試劑，所述試劑包含：
[0020] (a)上調(diào)mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-1299及其成熟miRNA的活 性的試劑；
[0021] (b)藥劑學(xué)上能接受的載體。
[0022] 優(yōu)選的，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術(shù)和/或基因特異性miR Mimics技 術(shù)上調(diào)mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-1299及其成熟miRNA的活性。優(yōu)選人 工合成miR-1299的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)或通過調(diào)控啟動子上調(diào)mir-1299及其成熟miRNA的表達(dá)。
[0023] 進一步的，所述骨肉瘤為轉(zhuǎn)移性骨肉瘤。
[0024]本發(fā)明的目的在于提供一種骨肉瘤診斷試劑，骨肉瘤診斷試劑能夠檢測骨肉瘤樣 本中mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或免疫檢測方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1299及其成熟 miRNA調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。
[0025] 進一步，骨肉瘤診斷試劑基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于 探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或基于免疫方法檢測骨肉 瘤樣本中mir-1299及其成熟miRNA調(diào)控的革E1基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用northern雜交方法、 miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉 瘤樣本中-^299及其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄;采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測骨肉瘤樣本 中mir-1299及其成熟miRNA調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。優(yōu)選所述mir-1299及其成熟miRNA調(diào) 控的靶基因為C5AR1和/或ITPRIP，ELISA和/或膠體金試紙條中含有與C5AR1和/或ITPRIP蛋 白特異性結(jié)合的抗體。
[0026] 本發(fā)明的目的在于提供上述防治骨肉瘤的制劑在制備骨肉瘤治療藥物或試劑中 的應(yīng)用。
[0027]定義：
[0028] 現(xiàn)階段檢測miRNA的表達(dá)水平的方法主要包括基于高通量測序技術(shù)、基于核苷酸 雜交和基于PCR的miRNA檢測方法?；谔结橂s交技術(shù)的miRNA檢測方法是一種直接檢測法， 不需要對樣本RNA進行預(yù)擴增，包括northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護分析技 術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。
[0029] (1 )Northern 雜交
[0030]又稱RNA印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測真核生物RNA大小，估計其豐度的實驗方法。基 本原理如下：首先在載體(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA樣本，再與經(jīng)過標(biāo)記的探針雜 交，洗滌多余的雜交探針后進行信號檢測；也可以在載體上先固定與靶mi