RNA序列互補(bǔ)的 DNA探針，然后與經(jīng)過標(biāo)記的樣本miRNA雜交，再進(jìn)行信號檢測。信號標(biāo)記的方法包括同位素 標(biāo)記、熒光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。
[0031] (2)miRNA表達(dá)譜芯片
[0032]原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測固相支持物上的目標(biāo)分子。通過設(shè)計(jì)芯片上miRNA 基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平?；蛐酒哂懈咄康膬?yōu) 點(diǎn)，可以一次在同一樣本中檢測出幾百個(gè)基因的全部表達(dá)。Luminex公司研制的液相芯片 (Liquid chip)又稱多功能懸浮點(diǎn)陣（Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新 一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不 同的探針分子，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個(gè)獨(dú)特的 色彩編號，將這些小球體懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對同 一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同分子同時(shí)進(jìn)行快速的定性、定量分析，這種檢測技術(shù)被稱為 FMAP(Flexible multianalyte profiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測速度極 快。
[0033] (3)核酶保護(hù)分析技術(shù)(RPA)
[0034] miRNA的檢測還可以采用核酶保護(hù)分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測RNA樣本混 合，熱變性后雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受 保護(hù)的RNA分子，最后通過變性PAGE電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡單 快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
[0035] (4)RAKE法
[0036] RAKE法（RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基 礎(chǔ)上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA與固定的DNA探針雜交的方法。RAKE可以敏感 特異地檢測miRNA，適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中 檢測miRNA表達(dá)譜情況。不僅如此，RAKE法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中 分離出miRNA并對其進(jìn)行分析，為從存檔標(biāo)本中分析miRNA開啟了希望之門。
[0037] (5)原位雜交（in situ hybridization)
[0038] 原位雜交技術(shù)可直觀了解miRNA表達(dá)方式，是觀測miRNA時(shí)空表達(dá)的一種較簡便的 方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針方 式。
[0039] (6)基于微球的流式細(xì)胞術(shù)(bead-based flow cytometry)
[0040] 是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來，兼有 通量大、檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)。
[0041] (7)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR，RT-PCR)
[0042] 熒光檢測PCR儀可對整個(gè)PCR過程中擴(kuò)增序列的累積速率繪制動態(tài)變化曲線。在反 應(yīng)混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴(kuò)增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的PCR循環(huán)數(shù)(一般用 特定閾值循環(huán)數(shù)Ct來表達(dá))越少。由于miRNA長度僅為22nt，傳統(tǒng)的qRT-PCR不適合擴(kuò)增如此 短的片段。現(xiàn)今有幾種用于miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR方法，如加尾法、頸環(huán)法等。頸環(huán)法是一種 理想的miRNA檢測qRT-PCR方法:首先設(shè)計(jì)特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測miRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄 合成cDNA第一鏈，該cDNA-端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開便增加了 cDNA的長度，隨后 以合成的cDNA為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。qRT-PCR具有特異性高、靈敏度好、快 速簡單等多種優(yōu)點(diǎn)。
[0043] (8)測序法
[0044] 大部分已知的miRNA都是通過cDNA克隆測序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建miRNA 的cDNA文庫，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體上測序。Takada開發(fā)了一種改 進(jìn)的擴(kuò)增克隆法(miRNA amp 1 if i cat ion prof i ling，mRAP)，mRAP 法先在 miRNA的 3 ' 端連上 接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樘囟ǖ姆崔D(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸 轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會連接到反轉(zhuǎn)錄出的cDNA鏈的3 '末端。當(dāng)5 ' 端接頭與cDNA鏈的poly (C)粘性末端退火后，加入一對共用引物即可實(shí)現(xiàn)對cDNA的PCR擴(kuò) 增。由于mRAP高度靈敏，可以直接用克隆和測序技術(shù)檢測少量組織中miRNA的表達(dá)量。標(biāo)簽 序列克隆法是一種在在基因表達(dá)系列分析（SAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測效率更高的 miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，該法通過生成大的串聯(lián)子，通過單個(gè)測序反應(yīng)可檢測多個(gè) miRNA，明顯提高了檢測效率。
[0045] 高通量測序（High-throughput sequencing)又稱下一代測序技術(shù)（next generation sequencing)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，極大提高了測序效率。這類大規(guī)模測序技術(shù)極大的提高了多個(gè)物種遺 傳信息的解讀速度，為獲取所有miRNA的序列信息，解密miRNA圖譜提供了保證。同時(shí)高通量 測序使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度 測序（deep sequencing)。高通量測序平臺的代表是羅氏公司（Roche)的454測序儀(Roch GSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer)和 ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer)。
[0046] 免疫檢測方法是以一種抗體或多種抗體作為分析試劑，對待測物進(jìn)行定量或定性 分析的檢測方法。其基本原理是抗體和抗原之間的相互作用。為提高抗原和抗體檢測的敏 感性，將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)，通過檢測標(biāo)記物，反映有無抗原抗體反應(yīng)， 從而間接測出微量的抗原或抗體。常用的標(biāo)記物有酶、熒光素、放射性同位素、膠體金及電 子致密物質(zhì)等。這種抗原或抗體標(biāo)記上顯示物所進(jìn)行的特異性反應(yīng)稱為免疫標(biāo)記技術(shù) (immunolabelling technique)。目前應(yīng)用最廣的免疫檢測技術(shù)主要有:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，膠體金免疫層析法等。
[0047] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理是將抗原或抗體與底物(酶)結(jié)合，使其保持免疫反應(yīng)和酶 的活性。把標(biāo)記的抗原或抗體與包被于固相載體上的配體結(jié)合，再使之與相應(yīng)的無色底物 作用而顯示顏色，根據(jù)顯色深淺程度目測或用酶標(biāo)儀測定0D值判定結(jié)果。
[0048] 膠體金試紙條一般由樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水墊四部分組成。層析材料有硝 化纖維膜(NC)、聚酯膜、尼龍膜和PVDF膜等，根據(jù)試驗(yàn)需要可選擇不同要求的膜，其中NC膜 最為常用，使用前可根據(jù)試驗(yàn)具體情況確定是否需要活化或處理，多數(shù)情況下無需處理，即 可直接使用。將金標(biāo)蛋白溶液均勻噴涂在金標(biāo)墊上，于室溫下晾干備用。NC膜可捕獲一定量 的包被(抗體)和二抗作為檢測線和質(zhì)控線。最后將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙依次固定 于PVC板，即成試紙條。
[0049] 基于RNA的microRNA功能獲得性技術(shù)即通過外源性補(bǔ)充miRNAs合成的前體物質(zhì)來 升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成與內(nèi)源性miRNA序列一致的短發(fā)夾樣RNA( short hairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做啟動子，以病毒為載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被Dicer酶修飾 后載入RISC發(fā)揮作用，相當(dāng)于升高pre-miRNA的水平，作用效果穩(wěn)定而持久。
[0050] 基因特異性miR Mimics技術(shù)該技術(shù)避免了miRNA與基因的非特異性作用。這種人 工合成的與靶基因3'UTR互補(bǔ)結(jié)合的特異性寡核苷酸鏈，能夠起到與miRNA相同的轉(zhuǎn)錄后調(diào) 節(jié)作用。
[0051] 包含在本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上許可的載體為在制劑時(shí)通常利用的載 體，該載體包含乳糖（lactose)、右旋糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘 露醇(mannitol )、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸|丐、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、娃酸|丐、 微晶纖維素、聚乙稀吡略燒酮化〇17￥；[117]^71'1'〇1丨(1〇116)、纖維素(0611111〇86)、水、糖衆(zhòng)、甲 基纖維素 (methyl cellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羥基苯 甲酸丙酯（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearic acid magnesium)及礦物 油(mineral oil)等，但并非局限于此。
[0052]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香 味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細(xì)記載于雷明登氏 藥學(xué)全書。
[0053]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能通過口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時(shí)，能通 過靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮 給藥等方式進(jìn)行給藥。
[0054]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可以 進(jìn)行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預(yù)防有效的給 藥劑量。
[0055]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易實(shí)施 的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來進(jìn)行制劑