一種基于重組酶聚合酶擴增技術原理的組織胞漿菌感染分子診斷試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及分子檢測技術領域，具體地說，涉及一種基于重組酶聚合酶擴增技術 原理、可早期診斷組織胞漿菌感染的分子診斷試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 組織胞漿菌屬是一個常見于鳥類和蝙蝠糞便的雙相型真菌屬，在自然狀態(tài)下為菌 絲相，而在動物或人體內轉化為酵母相。組織胞漿菌屬包含三個物種，即莢膜組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum)、莢膜組織胞衆(zhòng)菌杜氏變種（Histoplasma var · duboisii)和馬 皮疽莢膜組織胞楽菌(Histoplasma capsulatum var .farciminosum)。其中，馬皮疽莢膜組 織胞漿菌主要感染動物，在馬等動物中造成淋巴管炎家畜流行??；而組織胞漿菌病 (Histoplasmosis，HP)是由雙相型組織胞衆(zhòng)菌所引起的廣泛分布于全球的真菌病，其主要 分為由莢膜組織胞漿菌所引起的美洲型HP和由莢膜組織胞漿菌杜氏變種所引起的非洲型 HP〇
[0003] 人類常因吸入被鳥類或蝙蝠糞便污染的泥土或塵埃中的真菌孢子而感染。臨床誤 診率、死亡率高達80%。1906年美國軍事病理學家塞繆爾?泰勒?達林報道了首例，當時研 究表明最普遍的是俄亥俄州和密西西比河谷。近百年來的研究大多認為該病是一種地方性 流行病，臨床表現多樣，總體分為無癥狀型、急性肺型、播散型以及慢性肺型，主要流行于美 洲、非洲、亞洲等地區(qū)，歐洲相對少見，故既往該病在我國未引起足夠重視，然而近20年來相 關報道呈上升趨勢，例如桂希恩等流行病學調查顯示我國存在組織胞漿菌感染的人群，并 且有地域差異，東南部地區(qū)感染率高于西北部;肺部疾病患者感染率高于正常人，尤以肺結 核患者為高。值得注意的是，由于莢膜組織胞漿菌在形態(tài)上和馬爾霉尼青霉菌無法可靠區(qū) 分，明確診斷需要培養(yǎng)和血清血試驗，費時費力，對實驗室資質要求高，故該病的診斷學技 術現狀遠不能滿足臨床實際需要。
[0004] 而且，HP感染的預后與能否早期明確診斷密切相關，因此如何推動HP診斷的研究， 盡快開發(fā)出快速、特異且易于操作的診斷技術方法，是目前臨床HP感染早期檢測技術研究 迫切需要解決的重要問題。目前，國內外臨床真菌實驗室血清學試驗曾使用乳膠凝集、免疫 擴散、補體結合、免疫螢光及放射免疫檢驗抗體，但發(fā)病早期診斷率低。組織胞漿菌素皮試 可能有助于慢性患者的診斷，但免疫缺陷者常不出現反應，因此皮膚試驗僅主要用于流行 病調查。近來國外亦常檢測患者尿液、血清、胸水或腦脊液的組織胞漿菌多糖抗原，其中尿 液陽性率最高，并提示活動性感染，可作早期診斷依據。以培養(yǎng)、病理檢查為代表的病原真 菌形態(tài)學診斷方法雖有耗時長等局限，但仍是臨床上侵襲性真菌病診斷的金標準，組織胞 漿菌病亦不例外。由于其菌體大小及形態(tài)與利什曼原蟲無鞭毛體相似，二者常被混淆，后者 存在細小桿狀著色深的動基體，而前者無動基體，這是形態(tài)上區(qū)別兩種病原體的關鍵，但是 卻對病理鏡檢人員要求頗高。最可靠的病原診斷是真菌培養(yǎng)或動物接種，骨髓、病變組織穿 刺物、血、痰均可作培養(yǎng)，但存在假陰性率較高、耗時長(培養(yǎng)時間至少2周)等缺陷。近年來， 非培養(yǎng)診斷技術逐漸成為國內外侵襲性真菌病早期診斷技術研究的熱點，其技術路線主要 是基于免疫學原理的血清學方法和以核酸檢測技術為代表的分子生物學方法。總體而言， 這兩大類技術方法各有優(yōu)勢，雖然部分血清學技術方法經過改進相對成熟，敏感性及特異 性尚可，但基于免疫學原理的固有屬性也導致無法規(guī)避假陽性、假陰性等問題;而以核酸檢 測技術為代表的分子生物學技術方法雖尚未完全成熟，但具有很好地彌補目前血清學方法 的弊端的技術優(yōu)勢，具有較高的發(fā)展?jié)摿εc臨床應用價值。
[0005] 基于核酸檢測原理的HP早期診斷技術主要包括DNA條形碼圖譜技術和DNA序列分 析等。理論上講，DNA序列分析是鑒定組織胞漿菌的金標準。但PCR技術需要PCR儀器，對基礎 設施和人員要求較高，常因國內實驗室不能嚴格分區(qū)、實驗人員經驗不足加上高靈敏度、易 污染使結果呈現假陰性、假陽性等。重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術，由英國公司TwistDx Inc開 發(fā)。RPA技術主要依賴于三種酶:能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋 白（SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37°C 左右。以此為基礎的TwistAmp⑧核酸擴增產品能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸 檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、 農業(yè)等領域。目前RPA技術被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡 萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙門氏菌、大腸埃希菌STEC等常見 致病菌的檢測。
[0006] 綜上所述，基于針對組織胞漿菌菌株基因組各DNA片段的序列分析，篩選出適當的 靶基因，研發(fā)一種基于RPA技術原理的組織胞漿菌感染早期快速診斷的技術方法，對于解決 臨床上組織胞漿菌感染確診時間周期長、對檢測人員技術和實驗室平臺條件要求高等問題 具有十分重要的意義，將為臨床上早期診斷和及時治療提供便利。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種可早期診斷組織胞漿菌感染的 引物對。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的引物對的用途。
[0009] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種可早期診斷組織胞漿菌感染的試劑盒。
[0010] 為實現上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0011] -種可早期診斷組織胞漿菌感染的引物對，所述的引物對由核苷酸序列分別為 SEQN0.1和SEQN0.2的兩條引物組成。
[0012] 為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0013] 如上所述的引物對在制備早期診斷組織胞漿菌感染的試劑中的用途。
[0014] 如上所述的引物對在制備檢測樣品中組織胞衆(zhòng)菌存在的試劑中的用途。
[0015] 如上所述的引物對在制備試劑中的用途，所述的試劑用于從粗球孢子菌 (Coccidioides immitis)、申克抱子絲菌（Sporothrix schenckii)、馬爾尼菲青霉菌 (Penicillium marneffei)、膠囊青霉菌(Penicillium capsulatum)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、尼日爾黑曲霉(Aspergillus niger)、雜色曲霉(Aspergillus versicolor)、 雅致鱗質霉（Apophysomyces elegans)、苯黑末節(jié)皮真菌(Arthroderma benhamiae)、皮炎 芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球抱子菌(Coccidioides posadasii)、熱帶 金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、嗜角質金抱子菌（Chrysosporium keratinophilum)、據形放線菌（Ctenomyces serratus)、絮狀表皮癬菌（Epidermophyton floccosum)、巴其斤德金抱子菌（Emmonsia pasteurian)、小金抱子菌（Emmonsia parva)、尖 孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)、前病鐮刀菌（Fusarium solani)、里西裸囊菌 (Gymnoascus reessii)、犬小抱子菌（Microsporum canis)、石膏樣小抱子菌(Microsporum gypseum)、馬蹄足小抱子菌（Microsporum equinum)、卷枝毛霉（Mucor circinelloides)、 印度毛霉菌(Mucor indicus)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、阿薩絲抱酵母 (Trichosporon asahii)、皮瘤絲抱酵母（Trichosporon inkin)、紅色毛癬菌 (Trichophyton rubrum)、米根霉（Rhizopus oryzae)、糖批馬拉色菌（Malassezia furfur)、白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、熱帶假絲酵母 (Candida tropicalis)、鏈狀假絲酵母菌（Candida catenulata)、克柔念珠菌（Candida krusei)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隱球菌(Cryptococcus Gattii)中 鑒別出組織胞漿菌。
[0016] 為實現上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0017] -種可早期診斷組織胞漿菌感染的試劑盒，所述的試劑盒包含如上所述的引物 對：
[0018] 所述的試劑盒還進一步包括 rwistAnip'? RPA Rehydration Buffer、magnesium [0019]本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0020]本發(fā)明針對組織胞漿菌我國臨床最常見的優(yōu)勢分布的變種組織胞漿菌莢膜變種 的rDNA區(qū)