組織胞漿菌作為陽性對照，雙蒸水組作為陰性對照。
[0075] 2 RPA凝膠電泳檢查
[0076] ①用HE120電泳儀提供的灌膠模具灌制12cmX6cm的1.5%瓊脂糖凝膠:在燒杯中 加入1.5g瓊脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混勻，加熱煮沸，立即將膠液加入灌膠板中， 避免產(chǎn)生大量氣泡，室溫放置至凝膠凝固；
[0077] ②在裝有 1XTAE緩沖液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，lmM EDTA)的電泳槽內(nèi)， 小心平放入瓊脂凝膠，使其浸沒；
[0078] ③每個RPA反應體系中抽取5yL，分別與lyL 5x Ladder Buffer充分混合后上樣于 1.5 %的瓊脂凝膠；
[0079] ④120伏電壓電泳30min;
[0080]⑤將瓊脂凝膠浸入EB溶液15min;
[0081 ] ⑥小心取出后浸入雙蒸水中l(wèi)Omin;
[0082]⑦取出瓊脂凝膠經(jīng)FR-980復日生物電泳圖像分析系統(tǒng)拍照。
[0083](四）敏感性實驗 [0084] 1擴增曲線
[0085]將組織胞漿菌全基因組DNA濃度分別十倍梯級稀釋數(shù)次，使DNA含量分別為53ng、 5 · 3ng、530pg、53pg、5 · 3pg、530fg、53fg、ddH2〇。將上述不同濃度梯度的DNA分別按照上述 RPA體系，38°C，30min反應，結(jié)束后觀察擴增情況。設(shè)立不含DNA組為陰性對照。
[0086] 2 RPA產(chǎn)物凝膠電泳檢查
[0087] ①用HE120電泳儀提供的灌膠模具灌制12cmX6cm的1.5%瓊脂糖凝膠:在燒杯中 加入1.5g瓊脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混勻，加熱煮沸，立即將膠液加入灌膠板中， 避免產(chǎn)生大量氣泡，室溫放置至凝膠凝固；
[0088] ②在裝有 1XTAE緩沖液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，lmM EDTA)的電泳槽內(nèi)， 小心平放入瓊脂凝膠，使其浸沒；
[0089] ③每個RPA反應體系中抽取5yL，分別與lyL5x Ladder Buffer充分混合后上樣于 1.5 %的瓊脂凝膠；
[0090] ④120伏電壓電泳30min;
[0091] ⑤將瓊脂凝膠浸入EB溶液15min;
[0092] ⑥小心取出后浸入雙蒸水中l(wèi)Omin;
[0093] ⑦取出瓊脂凝膠經(jīng)FR-980復日生物電泳圖像分析系統(tǒng)拍照。
[0094]三、實驗結(jié)果
[0095](一）引物驗證及篩選
[0096]據(jù)11抗原序列設(shè)計出的兩對引物中第二對引物反應后的凝膠電泳圖在250~500bp 間出現(xiàn)雜帶（圖3)，特異性不高。而第一對引物反應后的凝膠電泳圖顯示條帶清晰，無雜帶 (圖2)，十分便于結(jié)果的判定，不會產(chǎn)生干擾，進一步可顯著提高結(jié)果的準確性。
[0097](二)特異性實驗
[0098] 1將篩選出的第一對引物分別與各菌株DNA按照RPA體系進行反應，觀察分別的擴 增反應情況。具體如下表1所示。
[0099] 表1特異性實驗結(jié)果
[0100]
[0101]
[0102]
[0103] 注:撲(？08!^；!_￥6)表示陽性反應，叫他83七；!_￥6)表示陰性反應。
[0104] 2針對設(shè)計的引物，擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。由此可知:基于組織胞漿菌 Μ抗原序列設(shè)計的引物在RPA反應體系具有良好的特異性，除了組織胞漿菌菌株均出現(xiàn)陽性 結(jié)果外，其他菌株包括粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、申克孢子絲菌（Sporothrix schencki i )、馬爾尼菲青霉菌（Penici 11 ium marneff ei )、膠囊青霉菌（Penici 11 ium capsulatum)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、尼日爾黑曲霉(Aspergillus niger)、雜 色曲霉(Aspergillus versicolor)、雅致鱗質(zhì)霉(Apophysomyces elegans)、苯黑末節(jié)皮真 菌(Arthroderma benhamiae)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球抱子菌 (Coccidioides posadasii)、熱帶金抱子菌(Chrysosporium tropicum)、嗜角質(zhì)金抱子菌 (Chrysosporium keratinophilum)、據(jù)形放線菌（Ctenomyces serratus)、絮狀表皮癬菌 (Epidermophyton floccosum)、巴其斤德金抱子菌（Emmonsia pasteurian)、小金抱子菌 (Emmonsia parva)、尖抱鏡刀菌（Fusarium oxysporum)、前病鏡刀菌（Fusarium solani)、 里西裸囊菌（Gymnoascus reessii)、犬小抱子菌(Microsporum canis)、石膏樣小抱子菌 (Microsporum gypseum)、馬蹄足小抱子菌（Microsporum equinum)、卷枝毛霉（Mucor (3：[1'(3；!_1161101(168)、印度毛霉菌（]\111(3〇1'；!_11(1;!_(3118)、嗜熱毀絲霉（]\^〇61;!_〇卩1^11〇^ thermophi la)、阿薩絲抱酵母（Trichosporon asahii )、皮瘤絲抱酵母（Trichosporon inkin)、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum)、米根霉（Rhizopus oryzae)、糠批馬拉色菌 (Malassezia furfur)、白念珠菌（Candida albicans)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、 熱帶假絲酵母（Candida tropicalis)、鏈狀假絲酵母菌（Candida catenulata)、克柔念珠 菌（Candida krusei)、新型隱球菌（Cryptococcus neoforma ns)、格特隱球菌 (Cryptococcus Gattii)均未出現(xiàn)擴增反應。初步驗證了基于1抗原序列設(shè)計的RPA引物具 有較好的特異性。
[0105] (三)敏感性實驗
[0106] 針對設(shè)計的引物，不同濃度梯度的DNA與引物反應后擴增曲線如圖4所示?；诮M 織胞漿菌核糖體內(nèi)基因間隔區(qū)Μ抗原序列的RPA引物敏感程度可以達到530pg。
[0107] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種可早期診斷組織胞漿菌感染的引物對，其特征在于，所述的引物對由核苷酸序 列分別為SEQ NO. 1和SEQ NO.2的兩條引物組成。2. 權(quán)利要求1所述的引物對在制備早期診斷組織胞漿菌感染的試劑中的用途。3. 權(quán)利要求1所述的引物對在制備檢測樣品中組織胞漿菌存在的試劑中的用途。4. 權(quán)利要求1所述的引物對在制備試劑中的用途，其特征在于，所述的試劑用于從粗球 孢子菌、申克孢子絲菌、馬爾尼菲青霉菌、膠囊青霉菌、煙曲霉、尼日爾黑曲霉、雜色曲霉、雅 致鱗質(zhì)霉、苯黑末節(jié)皮真菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、熱帶金孢子菌、嗜角質(zhì)金孢子 菌、鋸形放線菌、絮狀表皮癬菌、巴斯德金孢子菌、小金孢子菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、里 西裸囊菌、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、馬蹄足小孢子菌、卷枝毛霉、印度毛霉菌、嗜熱毀 絲霉、阿薩絲孢酵母、皮瘤絲孢酵母、紅色毛癬菌、米根霉、糠秕馬拉色菌、白念珠菌、光滑念 珠菌、熱帶假絲酵母、鏈狀假絲酵母菌、克柔念珠菌、新型隱球菌、格特隱球菌中鑒別出組織 胞漿菌。5. -種可早期診斷組織胞漿菌感染的試劑盒，所述的試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引 物對。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對，所述的試劑盒還進一步包括TwistAmp?RPA Rehydration Buffer、magnesium acetate。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于重組酶聚合酶擴增技術(shù)原理的組織胞漿菌感染分子診斷試劑盒及其應用。本發(fā)明針對組織胞漿菌我國臨床最常見的優(yōu)勢分布的變種組織胞漿菌莢膜變種的rDNA區(qū)域的M抗原基因設(shè)計了引物，并分別與30株組織胞漿菌標準株和臨床與環(huán)境分離菌株以及50株相關(guān)種屬菌株的DNA按照RPA體系進行反應，證實了該引物具備優(yōu)異的特異性。本發(fā)明還通過靈敏度試驗證實了該引物具備很高的靈敏度。因此，本發(fā)明的引物可用于組織胞漿菌感染的臨床早期診斷，解決了臨床上組織胞漿菌感染確診時間周期長、對檢測人員技術(shù)和實驗室平臺條件要求高等問題，可將該引物制備成試劑盒，為臨床上組織胞漿菌感染的早期診斷和及時治療提供便利。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105483278
【申請?zhí)枴緾N201610079835
【發(fā)明人】李娟 , 陳敏, 潘煒華, 廖萬清, 李穎芳, 洪南, 劉加, 方文捷
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年2月4日