一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程與適體技術(shù)，公開(kāi)了針對(duì)篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制物的噬菌體展示技術(shù)。具體而言，特指一種篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制物的技術(shù)，該方法同樣也適用于長(zhǎng)、短鏈N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(AHLs)的群體感應(yīng)分子抑制物的篩選。本發(fā)明中涉及的噬菌體展示技術(shù)可適用于例如噬菌體抗體庫(kù)、環(huán)肽、線性多肽等帶有隨機(jī)文庫(kù)的任何噬菌體文庫(kù)。涉及的宿主菌為可以被噬菌體文庫(kù)侵染的雄性F’細(xì)菌，例如ER2738、DH5a F’ ,XLl-Blue，涉及的載體為加入QS分子可導(dǎo)致自身基因誘導(dǎo)細(xì)菌死亡的載體pSB537。屬于病原微生物預(yù)防與控制領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌耐藥的形勢(shì)嚴(yán)峻，如何提高新藥研發(fā)速度，抑制或殺死病原菌的要求迫在眉睫。目前新藥的開(kāi)發(fā)主要有幾種方法:一是傳統(tǒng)的經(jīng)典方法，即從自然環(huán)境例如土壤或者植物中篩選天然抗生素或者抗菌物質(zhì)。但篩選天然抗菌物質(zhì)的方法存在著過(guò)程繁瑣，工作量大等問(wèn)題，需要在篩選規(guī)模與通量上得到質(zhì)的提高;二是人工合成或者半合成的抗生素，通過(guò)修改一些化學(xué)修飾改變化合物結(jié)構(gòu)，提高藥效。但由于同類合成的抗生素都具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，因此容易對(duì)同類耐藥細(xì)菌產(chǎn)生抗性;三、近十幾年來(lái)在國(guó)際知名藥物公司和科研機(jī)構(gòu)中發(fā)展十分迅速的高通量藥物篩選技術(shù)，使新藥的大規(guī)模篩選、靶點(diǎn)確認(rèn)、自動(dòng)化以及效價(jià)評(píng)估成為可能。同時(shí)，該技術(shù)也面臨著篩選模型與數(shù)據(jù)庫(kù)有限的技術(shù)難題;除上述幾種抑菌方法以外，還有一些利用細(xì)菌特殊生理功能以及重要靶點(diǎn)的新型抑菌藥物正在研究開(kāi)發(fā)。例如消除細(xì)菌生物膜生成、抑制細(xì)菌群體感應(yīng)以及抗體靶向抑制耐藥菌的策略。這些方法為新型藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路，有待于進(jìn)一步研究。
[0003]細(xì)菌的群體感應(yīng)(QS，quorum sensing)是指細(xì)菌根據(jù)自身細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的群體行為，研究發(fā)現(xiàn)，自然界中大部分的細(xì)菌都存在QS現(xiàn)象，它不僅控制細(xì)菌的生物發(fā)光，還與生物被膜和孢子生成、毒素分泌、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移以及包括抗生素在內(nèi)的第二代謝產(chǎn)物合成緊密相關(guān)。目前已知的細(xì)菌QS系統(tǒng)，可以根據(jù)分泌的化學(xué)信號(hào)分子性質(zhì)(又稱為自誘導(dǎo)物，AI，autoinducer)分為以下4類:一類信號(hào)分子為A1-1，是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(AHLs)及其衍生物，廣泛分布在革蘭氏陰性細(xì)菌中并具有種屬特異性。該類分子作用機(jī)理的研究相對(duì)比較透徹:AHLs分子由一系列具有相同高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和不同碳原子數(shù)目和飽和程度的酰胺側(cè)鏈構(gòu)成，N側(cè)鏈中的碳原子數(shù)多為偶數(shù)(只有C7—個(gè)奇數(shù))，從C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基團(tuán)。如圖1所示，以費(fèi)氏弧菌為例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并擴(kuò)散到細(xì)胞外，當(dāng)細(xì)胞密度增加到一定閾值時(shí)，AHLs與LuxR家族蛋白結(jié)合，從而使LuxR族蛋白與DNA上的調(diào)控元件結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄LuxCDABEG，啟動(dòng)生物發(fā)光過(guò)程;第二類是由LuxS家族蛋白形成的自誘導(dǎo)物A1-2，其主要成分為呋喃酮酰硼酸酯。文獻(xiàn)報(bào)道A1-2在多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中存在，是不同物種細(xì)菌間相互聯(lián)系的通用信號(hào)。另外兩類是在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中獨(dú)有的寡肽類分子AIP(Autoinducing peptide)以及目前機(jī)制還尚未完全清楚的腎上腺素/去甲腎上腺素信息系統(tǒng)(A1-3)信號(hào)分子。
[0004]由于QS在細(xì)菌的生命活動(dòng)中所起的重要作用，抑制細(xì)菌群體感應(yīng)并不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，但卻可以減少生物膜的生成、影響細(xì)菌毒素的分泌并且很難產(chǎn)生耐藥性，因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)QS相關(guān)基因或者其分泌的信號(hào)小分子物質(zhì)的抑制物，稱之為群體感應(yīng)抑制劑(QSI，quorum sensing inhibitor)或者群體感應(yīng)淬滅(QQ，quorum quenching)，是一個(gè)具有廣闊應(yīng)用潛力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物來(lái)源，成為當(dāng)前藥物開(kāi)發(fā)研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]
關(guān)于QSI分子的篩選，目前主要集中在對(duì)AHLs和A1-2的抑制上。QSI的來(lái)源可以大致分為4種，一種是從環(huán)境中提取的天然QSI分子。例如從海洋紅藻DeIisea pulchra、海洋珊瑚Eunicea knight1、大蒜等天然物質(zhì)中提取的AHLs和呋喃酮類物質(zhì);一種是根據(jù)信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)，人工設(shè)計(jì)和合成其相似結(jié)構(gòu)分子，以達(dá)到與QS分子競(jìng)爭(zhēng)底物但又不激活活性的目的；還有一種是利用表達(dá)QS分子降解酶的方法;此外，還有利用QS篩選特異抗體或者適體的方法。以上四種是當(dāng)前獲得QSI的主要來(lái)源，但是都存在一些問(wèn)題:植物等來(lái)源的樣品成份復(fù)雜，QSI前期的提取、鑒定和純化過(guò)程繁瑣而且還受到樣品純度與溫度、地域等不確定因素的限制;人工設(shè)計(jì)合成與抗體篩選不僅需要專業(yè)的化學(xué)合成與結(jié)構(gòu)分析背景，還要考慮到樣品制備過(guò)程的繁瑣程度，專業(yè)的設(shè)備、中間產(chǎn)物毒性與污染評(píng)估以及樣品純度等一系列問(wèn)題。
[0006]這些問(wèn)題制約著QSI分子篩選的進(jìn)一步發(fā)展，急需一種能快速、高通量地篩選出高效QSI分子的新方法。因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:建立一種簡(jiǎn)單、快速地篩選抑制不同類型QS分子特異性多肽的方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
將噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)與QS自殺感應(yīng)菌株相結(jié)合的方法來(lái)篩選QSI分子。噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)(Phage display)，是將一段長(zhǎng)度大約為15-36 bp的隨機(jī)核苷酸序列插入■菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因內(nèi)，外源短肽隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面。理論上，7個(gè)隨機(jī)氨基酸序列可產(chǎn)生約207種多肽序列，可以作為“人工抗體”，篩選出能特異性結(jié)合靶物質(zhì)的多肽。該技術(shù)一般采用生物淘選(B1panning)的方法來(lái)篩選抗原表位，其基本技術(shù)流程大致為:將靶蛋白或物質(zhì)包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌體展示肽庫(kù)與之特異性結(jié)合，經(jīng)過(guò)多輪的清洗和篩選后，獲得與靶物質(zhì)結(jié)合較緊密的噬菌體克隆，最終確認(rèn)特異的短肽序列。但由于本專利研究的靶物質(zhì)是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(AHLs)以及呋喃酮酰硼酸酯等小分子物質(zhì)，很難直接包被在平板上進(jìn)行富集，因此本專利中采用一個(gè)與傳統(tǒng)生物淘選方法完全不同的特異多肽篩選策略。主要原理是如圖2所示:感應(yīng)到QS分子將致死的感應(yīng)菌株與噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)孵育侵染，在添加入相應(yīng)抗生素、特異QS信號(hào)分子、致死條件誘導(dǎo)劑和IPTG/X-gal誘導(dǎo)孵育平板長(zhǎng)菌。在自然光下，沒(méi)有被噬菌體侵染的細(xì)菌不顯藍(lán)色，噬菌體侵染的細(xì)菌顯藍(lán)色;在加入致死條件誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，具有抑制QS功能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動(dòng)自殺基因的表達(dá)，因此存活。而非特異多肽無(wú)法抑制QS分子，導(dǎo)致自殺基因啟動(dòng)致死。然后將存活的候選克隆挑出來(lái)，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，最后通過(guò)DNA測(cè)序的方法獲得特異多肽序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的QSI多肽。
[0008]本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的:如圖2所示，本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)利用M13噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)篩選QSI多肽的方法。以QS分子C4-AHL感應(yīng)致死載體PSB537為例，如圖2所示，該質(zhì)粒帶有嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)AhyRI’和條件致死基因SacB，AhyR蛋白感應(yīng)C4-AHL分子，激活A(yù)hyI ’啟動(dòng)子，誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)SacB蛋白。在添加自殺誘導(dǎo)物20%蔗糖后，可導(dǎo)致細(xì)菌死亡，只有添加或者產(chǎn)生QSI分子才能使細(xì)胞存活。然后利用M13噬菌體不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染攜帶pSB537的F’大腸桿菌，在添加C4-AHL分子、四環(huán)素、氨芐青霉素、20%蔗糖和IPTG/X-gal的平皿中篩選出在可見(jiàn)光下顯藍(lán)色、12小時(shí)孵育后能正常生長(zhǎng)的噬菌斑。然后將該噬菌體擴(kuò)增，加入帶有pSB536的QS感應(yīng)菌株中，通過(guò)抑制生物發(fā)光的方法驗(yàn)證QSI功能，最后測(cè)序獲得特異QSI多肽序列。需要指出的是，目前已經(jīng)有利用自殺基因SacB或者PhlA來(lái)篩選QSI的載體，例如QSISl和QSIS213，因此本專利重點(diǎn)描述的是利用噬菌體展示技術(shù)與QS感應(yīng)自殺載體結(jié)合的技術(shù)。
[0009]所述方法具體包括如下:
(1)將QS信號(hào)分子C4-AHL感應(yīng)自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌ER2738菌株，獲得菌株，從劃線平板中挑取該單菌落并接種到5 ml添加有20 yg/mL四環(huán)素和100 yg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 0C,250 rpm振蕩過(guò)夜，以2 %接種量轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，然后在200 rpm條件下振蕩至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期并收集I mL菌體后重懸于200 yL LB培養(yǎng)基中待用；
(2)將噬菌體肽庫(kù)放置冰上化凍，取10yL稀釋到90此無(wú)菌水中，再分別將步驟(I)中待用重懸后的200yL菌液與10 yL已稀釋的噬菌體肽庫(kù)輕輕混勻