mH1、EcoRI替換成致死基因序列SacB，經(jīng)測(cè)序及功能驗(yàn)證后保存于-20 °C備用，命名為pSB537;同時(shí)將噬菌體環(huán)7肽庫(kù)試劑盒中的侵染所用宿主菌ER2738利用氯化鈣法制備感受態(tài)(參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第四版)；然后取出核酸含量為100 ng的pSB537質(zhì)粒運(yùn)用熱激轉(zhuǎn)化法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入所制備的ER2738感受態(tài)中。以上該步驟的實(shí)施，有效的提高了本實(shí)驗(yàn)篩選的過(guò)程中噬菌體對(duì)宿主菌侵染能力，故將QS信號(hào)分子C4-AHL感應(yīng)自殺質(zhì)粒pSB537轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌ER2738菌株尤為必要。從劃線平板中挑取單菌落ER2738接種至5ml含有終濃度為20 yg/mL四環(huán)素和100 yg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中37 0C,250 rpm振蕩過(guò)夜;翌日，取過(guò)夜菌以1: 200轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，然后在200 rpm條件下振蕩至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期并收集I mL菌體后重懸于200 yL LB培養(yǎng)基中待用； (2)然后，將噬菌體C7C環(huán)肽文庫(kù)(NEB公司)放置冰上化凍，取出10yL稀釋至90 yL無(wú)菌水中，再分別將步驟(I)稀釋后待用的200此菌液與該稀釋后10此的噬菌體肽庫(kù)輕輕混勻，置于室溫條件下孵育2-5 min;接著吸取上述預(yù)混液加入45 °G溫浴已融化的含有10-30wt.%鹿糖、0.7 wt.%瓊脂粉的上層瓊脂LB培養(yǎng)基，迅速充分混勾并傾倒至含有終濃度為20 pg/mL 四環(huán)素、100 yg/mL 氨節(jié)青霉素、20 wt.% 鹿糖和10 μΜ C4_AHL、1.5wt.%瓊脂粉的IPTG/X-gal下層固體LB培瓊脂培養(yǎng)基平板上；除以上實(shí)驗(yàn)組之外，還設(shè)置了一組不添加信號(hào)分子的對(duì)照組，等待上層瓊脂充分凝固后，倒置放入37 °e培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 h;
(3)翌日，將過(guò)夜平板分別在白光光源下拍照比對(duì)，分析比較在致死條件下能夠生長(zhǎng)且存在藍(lán)色噬菌斑的個(gè)體菌落，挑取該藍(lán)色單菌落以及對(duì)照未顯藍(lán)色單菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，并在在37 0C,250 rpm振條件下，培養(yǎng)5 h；
(4)此后，將轉(zhuǎn)接后的菌液離心取上清待用，與此同時(shí)，將原始含QS信號(hào)分子C4-AHL感應(yīng)質(zhì)粒PSB536菌株過(guò)夜活化后以體積比1:100轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中200 rpm 3 h，再將其以1:100稀釋于LB培養(yǎng)基中并添加終濃度為10 μΜ的C4-AHL混勻后，以每孔200 yL體積量添加于96孔黑色微孔板中，再外源添加篩選出陽(yáng)性結(jié)果的上清10此為實(shí)驗(yàn)組，并以不含信號(hào)分子為陰性對(duì)照以及含有信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)三個(gè)重復(fù);將上清液加入96孔黑色微孔板充分混勻后于37 °C培養(yǎng)箱，靜置過(guò)夜培養(yǎng)。
[0024](5)最后，利用化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)，將該過(guò)夜的96孔黑色微孔板在生物發(fā)光條件下拍照比對(duì)結(jié)果，其曝光時(shí)間為10 min。結(jié)果如圖5所示，不含外源添加物和添加隨機(jī)序列的噬菌體上清的陽(yáng)性對(duì)照發(fā)光強(qiáng)度和490 nm吸收光值最強(qiáng)，其他挑選的peptide 2_5上清與不添加信號(hào)分子的陰性對(duì)照一樣不發(fā)光。最終，將這些驗(yàn)證后目的噬菌斑擴(kuò)增后失活，送至北京金唯智測(cè)序公司測(cè)序，以進(jìn)行進(jìn)一步生物驗(yàn)證分析。
[0025]綜上所述，利用QS感應(yīng)自殺菌株可以被QSI抑制拯救的特性，結(jié)合噬菌體隨機(jī)文庫(kù)展示技術(shù)進(jìn)行QSI的篩選，解決傳統(tǒng)噬菌體文庫(kù)展示方法中，小分子物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以固定的難題，可以迅速、大規(guī)模地篩選針對(duì)各種不同類型QS分子的QSI;同時(shí)，根據(jù)QSI多肽的空間結(jié)構(gòu)，可以為研究與QS分子相互作用的天然蛋白三維構(gòu)象預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。因此，本專利具有理論與實(shí)際運(yùn)用的多重優(yōu)點(diǎn)。
[0026]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，其特征在于:所述方法為:感應(yīng)到QS分子將致死的感應(yīng)菌株與噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)孵育侵染，再添加入相應(yīng)抗生素、特異QS分子、致死條件誘導(dǎo)劑和IPTG/X-gal誘導(dǎo)孵育平板長(zhǎng)菌，在自然光下，沒(méi)有被噬菌體侵染的細(xì)菌不顯藍(lán)色，噬菌體侵染的細(xì)菌顯藍(lán)色;在加入致死條件誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，具有抑制QS功能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動(dòng)自殺基因的表達(dá)，因此存活;而非特異多肽無(wú)法抑制QS分子，導(dǎo)致自殺基因啟動(dòng)致死;然后將存活的候選克隆挑出來(lái)，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，最后通過(guò)DNA測(cè)序的方法獲得特異多肽序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的QSI多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，其特征在于:所述方法具體包括如下: (1)將QS信號(hào)分子C4-AHL感應(yīng)自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌ER2738菌株，獲得菌株，從劃線平板中挑取該單菌落并接種到5 ml添加有20 yg/mL四環(huán)素和100 pg/mL氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 0C,250 rpm振蕩過(guò)夜，以2 %接種量轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，然后在200 rpm條件下振蕩至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期并收集I mL菌體后重懸于200 pL LB培養(yǎng)基中待用； (2)將噬菌體肽庫(kù)放置冰上化凍，取10nL稀釋到90 HL無(wú)菌水中，再分別將步驟(I)中待用重懸后的200 HL菌液與10 HL已稀釋的噬菌體肽庫(kù)輕輕混勻，在室溫條件下孵育2-5min;吸取上述所有預(yù)混液加入3 mL、45 °G溫浴已融化的含有10-30 wt.%蔗糖、0.7 wt.%瓊脂粉的上層瓊脂LB培養(yǎng)基中，迅速充分混勻并傾倒到添加含有終濃度為20 pg/mL四環(huán)素、100 pg/mL 氨芐青霉素、10 μΜ C4-AHL、10-30 wt.%蔗糖、1.5wt.%瓊脂粉的IPTG/X-gal LB培養(yǎng)基平板上;待上層瓊脂充分凝固后，倒置放入37°?咅養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12-16 h; (3)翌日，將過(guò)夜平板分別在白光光源下拍照比對(duì)，分析比較在致死條件下能夠生長(zhǎng)且存在藍(lán)色噬菌斑的個(gè)體菌落，挑取該藍(lán)色單菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，并在在37 0C,250rpm振條件下，培養(yǎng)4-5 h； (4)然后將轉(zhuǎn)接后的菌液離心取上清待用，與此同時(shí)，將原始含pSB536質(zhì)粒菌株過(guò)夜活化后，按2 %接種量轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，再以體積比1:100稀釋于LB培養(yǎng)基后添加終濃度為10 μΜ C4-AHL信號(hào)分子待用，最后以每孔200 yL體積量添加于96孔黑色微孔板中，并將待用上清，即外源添加所篩選出陽(yáng)、陰性結(jié)果的上清10 UL加入到96孔黑色微孔板，充分混勻后于37 °(:多孔道酶標(biāo)儀中，在0D490 nm波長(zhǎng)下每小時(shí)監(jiān)測(cè)一次，共監(jiān)測(cè)12-16 h; (5)利用化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)，將該監(jiān)測(cè)后的96孔黑色微孔板在生物發(fā)光條件下拍照比對(duì)結(jié)果，其曝光時(shí)間為10 min;根據(jù)拍照結(jié)果，挑選出目標(biāo)噬菌體，最終，將目的噬菌體滅活后送測(cè)序。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，其特征在于:所述的IPTG/X-gal LB培養(yǎng)基制備方法為:稱取1.25 g IPTG.l g Χ-gal溶于25mL 二甲基甲酰胺為母液，然后用時(shí)按體積分?jǐn)?shù)為0.1%添加到LB培養(yǎng)基中；所述的LB培養(yǎng)基為5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化鈉，pH= 7.4-7.6,1000 mL。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，其特征在于:所述質(zhì)粒為PSB537，其制備方法為，將含有pSB536質(zhì)粒菌株利用堿裂解法提取該質(zhì)粒，利用分子改造技術(shù)將該質(zhì)粒中發(fā)光基因序列LuxCDABE替換成致死基因序列SacB，經(jīng)測(cè)序及功能驗(yàn)證后保存于-20 °C備用，發(fā)光基因序列LuxCDABE序列如SEQ ID N0.1所示致 死基因序列SacB序列如SEQ ID N0.2所不。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，在自然光下，沒(méi)有被噬菌體侵染的細(xì)菌不顯藍(lán)色，噬菌體侵染的細(xì)菌顯藍(lán)色；在加入致死條件誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，具有抑制QS功能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動(dòng)自殺基因的表達(dá)，因此存活；而非特異多肽無(wú)法抑制QS分子，導(dǎo)致自殺基因啟動(dòng)致死；然后將存活的候選克隆挑出來(lái)，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，最后通過(guò)DNA測(cè)序的方法獲得特異多肽序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的QSI多肽。本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單，只需要3天至一周左右的時(shí)間，就可以獲得多個(gè)QSI候選多肽，因此具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。
【IPC分類】C07K1/04
【公開號(hào)】CN105504002
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610039619
【發(fā)明人】林向民, 姚祖杰, 林文雄
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年1月21日