一種進(jìn)行固相pcr反應(yīng)的自動(dòng)化微流工作站及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種基于微流控芯片的固相PCR&單堿基延伸 反應(yīng)，對(duì)接核酸質(zhì)譜檢測(cè)，主要應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，尤其是一種適用于一站式自動(dòng) 化、多樣本、高通量、快反應(yīng)、低成本的SNP檢測(cè)樣本前處理，可與核酸質(zhì)譜檢測(cè)儀如MALDI-T0F-MS直接對(duì)接，進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是指?jìng)€(gè)體基因組內(nèi) 特定核苷酸位置上的單個(gè)堿基A，T，C，G的改變而引起的DNA序列的改變或突變，這種突變包 括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，只有當(dāng)?shù)任换虻念l率大于或等于1%時(shí) 才能稱得上是SNPs，然而部分SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)如HGVBase把等位基因的頻率小于1 %的變異也包 括在SNPs內(nèi)。研究表明，人類每對(duì)等位染色體上每lOOObp就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP，而整個(gè)人類基因 組每300bp就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP，在任意兩個(gè)個(gè)體之間，就有好幾百萬(wàn)的單堿基差異和十萬(wàn)個(gè)氨 基酸的不同，在一定程度上反映了人類個(gè)體或群體的特異性，也造成人類在內(nèi)的物種之間 染色體基因組的多樣性。
[0003] 對(duì)人類基因組的SNP進(jìn)行大規(guī)模的研究具有重要的意義，它不僅可以研究人類的 起源、進(jìn)化和群體遺傳學(xué)特征，而且為多基因病和復(fù)雜性疾病如人類腫瘤、糖尿病、心血管 疾病、自身免疫性疾病、精神病、老年性癡呆等相關(guān)基因的研究和藥物遺傳學(xué)的研究提供了 科學(xué)基礎(chǔ)和先進(jìn)手段。SNP檢測(cè)是目前基因診斷的主要研究?jī)?nèi)容。同時(shí)，SNP檢測(cè)所代表的基 因診斷也逐漸成為新生兒或特定人群遺傳病篩查的重要手段之一。
[0004] 由于SNP其重要性，并且隨著SNP研究的普及和深入，SNP的檢測(cè)方法目前已有了長(zhǎng) 遠(yuǎn)的發(fā)展，如全基因組測(cè)序，外顯子組測(cè)序，全基因組SNP芯片，質(zhì)譜法，SNPseq法，SNPlex， SNaPshot等，都可以快速、高效、較大通量檢測(cè)基因組中的SNP，但這些設(shè)備價(jià)格昂貴，僅適 用于大型實(shí)驗(yàn)室的研究，難以在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行普及。
[0005] 質(zhì)譜法是SNP位點(diǎn)檢測(cè)的常用方法和最具前景的技術(shù)。質(zhì)譜法是通過(guò)對(duì)物質(zhì)的分 子量(質(zhì)荷比）進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到區(qū)分、鑒別物質(zhì)的目的。SNP位點(diǎn)兩個(gè)等位基因之間存在分子 量差異，通過(guò)分型實(shí)驗(yàn)將差異放大，然后以質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)即可達(dá)到SNP分型的目的。其主 要是在緊挨SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段探針，在反應(yīng)體系中以雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP， dideoxy-nucleoside triphosphate)替代dNTP脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，deoxy-nucleotide thiophosphate))，使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止。根據(jù)SNP位點(diǎn) 的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質(zhì)譜儀可以檢測(cè)出這種微小的 分子量差異，從而實(shí)現(xiàn)SNP分型的目的。
[0006] 其中，MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)由專業(yè)生產(chǎn)生物芯片系統(tǒng)用于遺傳 突變及SNP領(lǐng)域研究的美國(guó)Sequenom公司開(kāi)發(fā)，是目前采用質(zhì)譜法直接檢測(cè)SNP的成熟設(shè) 備。該系統(tǒng)的突出特點(diǎn)是能以極高的精確度進(jìn)行基因型識(shí)別，直接測(cè)出帶有SNP或其他突變 的目標(biāo)DNA。由于質(zhì)譜法直接檢測(cè)分子的本質(zhì)特征-分子量，不需要通過(guò)熒光標(biāo)記來(lái)進(jìn)行間 接檢測(cè)，準(zhǔn)確可靠；靈敏度高，可檢測(cè)低至lOng的核酸片段。然而，國(guó)外公司利用質(zhì)譜儀對(duì) SNPs位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的方法，在樣本前處理過(guò)程中存在不少缺陷。如Sequenom的標(biāo)準(zhǔn)流程采 用的是兩步PCR:普通PCR預(yù)擴(kuò)增和單堿基延伸PCR擴(kuò)增，即放大含待檢測(cè)SNP位點(diǎn)的ssDNA模 板和放大含SNP位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物;PCR預(yù)擴(kuò)增需要45個(gè)循環(huán)，單堿基延伸循環(huán)需要40個(gè)外循 環(huán)且每個(gè)外循環(huán)又內(nèi)嵌5個(gè)內(nèi)循環(huán)反應(yīng);且在兩次PCR擴(kuò)增之間，還需要使用蝦堿性磷酸酶 (Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)消化除去第一次PCR反應(yīng)體系中剩余的dNTP和引物； 這樣就造成樣本處理時(shí)間的延長(zhǎng)、試劑消耗及檢測(cè)成本的增加，尤其整個(gè)流程操作需要長(zhǎng) 達(dá)10個(gè)小時(shí)左右，不利于樣本的即時(shí)檢測(cè)。
[0007] 微流控芯片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基 本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過(guò)程;其是生命科學(xué)、化學(xué)科學(xué) 與信息科學(xué)信號(hào)檢測(cè)和處理方法研究的重要技術(shù)平臺(tái)。近十年來(lái)，微流控芯片技術(shù)在生物、 醫(yī)學(xué)、臨床等領(lǐng)域得到了快速發(fā)展，尤其是核酸的擴(kuò)增及分析等（Zhang Y，0zdemir P.Analytica chimica acta,2009,638(2):115-125；Horsman K M,Bienvenue J M, Blasier K R.Journal of forensic sciences,2007,52(4):784-799.)〇
[0008] 在PCT號(hào)為PCT/US2012/056888中林巧、朱靜等人公開(kāi)了一種核酸在微芯片上的分 離和富集的方法:基于微流控芯片，以反應(yīng)微室中的磁珠為載體實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增及單堿基 延伸反應(yīng)，以檢測(cè)SNPs及分離和富集所需DNA分子。但其微芯片集成微加熱器和溫度傳感 器，以磁珠為反應(yīng)載體，若涉及不同樣本和不同SNP位點(diǎn)檢測(cè)，則需更換磁珠或其表面錨定 的引物，這樣就造成反應(yīng)過(guò)程中的操作繁瑣，且難以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的自動(dòng)化處理。
[0009] 綜上所述，現(xiàn)有的實(shí)現(xiàn)SNP位點(diǎn)檢測(cè)方法，存在以下問(wèn)題:樣本處理操作步驟繁瑣， 所需配備儀器設(shè)備較多且昂貴，人工操作帶來(lái)的干擾性大，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，難于實(shí)現(xiàn) 臨床中的即時(shí)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是為了提供一種基于微流控芯片作為反應(yīng)通道和固相載體，并利用 固相PCR擴(kuò)增方法和固相單堿基延伸方法，在功能集成的微流工作站中，進(jìn)行SNP檢測(cè)樣本 前處理，能夠和核酸質(zhì)譜檢測(cè)分析儀直接對(duì)接，檢測(cè)出SNP位點(diǎn)。該工作站基于微流控芯片 通道底面作為固相襯底錨定連接反向引物，并進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增反應(yīng)、變性-洗脫反應(yīng)、一步 單堿基延伸反應(yīng)和洗脫-變性反應(yīng):克服現(xiàn)有質(zhì)譜法檢測(cè)SNP樣本處理過(guò)程中需對(duì)樣本進(jìn)行 兩次多循環(huán)PCR擴(kuò)增反應(yīng)、SAP消化處理而導(dǎo)致的成本高、耗時(shí)、費(fèi)力等缺陷;借助集液路系 統(tǒng)、溫控裝置和控制系統(tǒng)等于一體的微流工作站實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的一站式自動(dòng)化操作；同時(shí)一次 性用的芯片避免樣本間的交叉污染，并可根據(jù)不同SNP位點(diǎn)和檢測(cè)需求量，使用不同類型芯 片和不同寡核苷酸序列;在工作站對(duì)樣本進(jìn)行處理后，可直接對(duì)接核酸質(zhì)譜分析儀;該工作 站具有一站式自動(dòng)化、較高通量、低成本、操作方便、快速高效、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
[0011] 在本文的各個(gè)方面，本發(fā)明包括可用于對(duì)一個(gè)或多個(gè)樣本，包括全血或DNA樣本， 進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增&單堿基延伸反應(yīng)的微流工作站，其包括微流控芯片、液路系統(tǒng)、溫控裝置 和控制系統(tǒng)等。其中，微流控芯片，提供反應(yīng)通道和固相襯底:所有反應(yīng)在一個(gè)或多個(gè)串聯(lián) 的反應(yīng)腔室或流道完成，通道底面的固相襯底平鋪錨定有反向引物，在固相襯底上可進(jìn)行 固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸反應(yīng);液路系統(tǒng)，連接微流控芯片，在反應(yīng)過(guò)程中，則用于在 特定時(shí)間和環(huán)境下控制引入特定的反應(yīng)試劑溶液至反應(yīng)腔室，與反向引物或目標(biāo)DNA片段 接觸反應(yīng);溫控裝置，緊貼芯片通道底面，主要為帕爾貼加熱片或其他加熱/冷卻裝置，在反 應(yīng)過(guò)程中為通道底面和反應(yīng)溶液試劑提供特定的溫度環(huán)境;控制系統(tǒng)，耦連液路系統(tǒng)和溫 控裝置，為用戶可操作系統(tǒng):可設(shè)置輸入相關(guān)信息參數(shù)，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑流速 等，并以此對(duì)控制系統(tǒng)和溫控裝置進(jìn)行監(jiān)測(cè)并反饋輸出指令集，使系統(tǒng)反應(yīng)能按照設(shè)定參 數(shù)自動(dòng)完成。
[0012] 在實(shí)施例中，微流控芯片材質(zhì)為金屬、玻璃、娃片和聚合物的一種或組合;微流控 芯片包括進(jìn)出口和通道，其中芯片可為一個(gè)或多個(gè)并行的通道，每個(gè)通道可為一個(gè)或多個(gè) 串行的反應(yīng)腔室或流道，通道底面為平面狀或有陣列凹池，錨定連接一種或多種反向引物； 通道底面-反向引物的連接方